基于甘露聚糖免疫层析法的无显微镜真菌组织检测技术

《Microbiology Spectrum》：A microscopy-free approach for detection of fungal elements in tissue using mannan immunoassay

　　

专业译文 KOH显微镜检查是确定受感染组织中是否存在真菌成分的常规方法。尽管该方法被广泛使用，但需要训练有素的人员和显微镜基础设施。另一种替代方法是提取真菌抗原并通过免疫分析法进行检测。在本研究中，研究人员采用次氯酸钠（sodium hypochlorite）进行氧化释放，从真菌细胞中提取甘露聚糖（mannan）。游离次氯酸钠的淬灭通过过量的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）或硫代硫酸钠（sodium thiosulfate）完成。淬灭试剂被整合到侧流免疫层析法（lateral flow immunoassays，LFIAs）的样品垫中，随后利用与胶体金偶联的甘露聚糖特异性单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）在LFIA平台上检测释放的甘露聚糖。使用念珠菌属（Candida spp.）或曲霉菌属（Aspergillus spp.）的细胞评估提取/淬灭步骤。结果表明，硫代硫酸钠特别适用于免手动、条内中和。念珠菌LFIA的分析灵敏度（最低检测限，limit of detection，LOD）为67 ng/mL甲醛灭活的全白色念珠菌（Candida albicans）细胞。曲霉菌LFIA的LOD为250 ng/mL甲醛灭活的全烟曲霉（Aspergillus fumigatus*）细胞。利用真菌性角膜炎（fungal keratitis）的离体猪角膜模型，证明了氧化释放甘露聚糖后通过LFIA检测抗原的概念验证。结果表明，该测试是一种快速的、从标本到结果的二步法方案，适用于即时检测（point-of-care，POC）。这种诊断方法在缺乏KOH显微镜检查所需训练有素人员或基础设施的环境中尤其有价值。

论文解读文章

研究背景与目的

真菌感染的实验室诊断长期依赖于氢氧化钾（KOH）显微镜检查，这是一种直接观察临床标本中真菌成分的经典方法。尽管KOH镜检成本低廉且具有广谱适用性，但其应用受到诸多限制：需要配备显微镜等基础设施并保证其日常维护，依赖经过专业培训的操作人员进行判读，无法提供菌种鉴定信息，且可能因人为假象导致假阳性结果。此外，该流程通常只能在专科诊所完成，若将标本送至参考实验室则无法实现患者就诊期间的即时诊断。为解决上述瓶颈，研究人员提出了一种无需显微镜的替代策略——通过提取感染组织中真菌细胞壁的甘露聚糖（mannan）生物标志物，并利用免疫分析方法进行检测。甘露聚糖作为子囊菌门（Ascomycete）和接合菌门（Zygomycete）真菌细胞壁的保守成分，其α-1,6-连接的甘露聚糖主链可作为跨属免疫检测的靶点，而侧链取代基则为更特异的检测提供了可能。然而，与循环系统中脱落型甘露聚糖不同，完整组织中的甘露聚糖需经有效提取后方可被免疫检测。本研究旨在开发一种结合氧化释放与侧流免疫层析法（LFIA）的快速、简便、适用于资源有限环境的真菌检测方案。

研究方法概述

研究人员首先制备了针对念珠菌属（Candida spp.）和曲霉菌属（Aspergillus spp.）的甘露聚糖特异性单克隆抗体（mAbs），分别命名为2A4和9H11，并通过双向免疫扩散（Ouchterlony double immunodiffusion）评估其属内包容性与属间特异性。随后，研究人员构建了基于胶体金纳米颗粒标记抗体的LFIA试纸条，并在样品垫中整合了次氯酸钠（NaClO）中和试剂（硫代硫酸钠或BSA），以实现免手动的条内淬灭。利用甲醛灭活的白色念珠菌（Candida albicans）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）细胞优化了提取条件（次氯酸钠浓度）与中和条件（淬灭剂浓度），并确定了分析灵敏度。最终，研究人员在真菌性角膜炎的离体猪角膜模型中进行了概念验证，该模型使用了来自ATCC和IHMA细菌库的菌株，包括黄曲霉（Aspergillus flavus）、茄病镰刀菌（Fusarium keratoplasticum）、白色念珠菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

研究结果

mAb特异性和包容性

通过双向免疫扩散实验，抗念珠菌mAb 2A4与白色念珠菌、耳念珠菌（C. auris）、光滑念珠菌（C. glabrata）和热带念珠菌（C. tropicalis）的甘露聚糖形成沉淀线，但与克柔念珠菌（C. krusei）、近平滑念珠菌（C. parapsilosis）、根霉属（Rhizopus）、毛霉属（Mucor）、镰刀菌属（Fusarium）、曲霉菌属或毛癣菌属（Trichophyton）无反应，仅与青霉菌属（Penicillium）产生微弱条带。抗曲霉菌mAb 9H11与所有测试的曲霉菌种及青霉菌的甘露聚糖形成沉淀线，但与根霉、毛霉、镰刀菌或毛癣菌无反应。

提取条件优化

以10,000 ng/mL的固定细胞浓度，经不同浓度次氯酸钠处理4分钟后，通过整合过量中和试剂的LFIA检测释放的甘露聚糖。结果显示，0.025%~0.1%次氯酸钠可获得最大检测信号，低于此浓度提取不充分，高于此浓度则因抗体氧化导致信号下降。据此，0.05%次氯酸钠被选为最优提取浓度。

中和条件优化

将含不同浓度硫代硫酸钠或BSA的样品垫加入0.05%次氯酸钠溶液后，使用氯试纸检测残余游离氯。结果显示，≥0.05 M硫代硫酸钠或≥4% BSA可实现完全中和。进一步比较发现，0.1 M硫代硫酸钠处理的样品垫产生的测试线信号略高于1 M组，因此选择0.1 M硫代硫酸钠用于后续原型构建。

分析灵敏度

利用优化的提取与中和条件，对系列稀释的甲醛灭活真菌细胞进行评估。念珠菌LFIA对白色念珠菌的检测限（LOD）为67 ng/mL，对光滑念珠菌为1,000 ng/mL，但对克柔念珠菌和近平滑念珠菌的LOD均>20,000 ng/mL。曲霉菌LFIA对烟曲霉、黑曲霉（A. niger）和黄曲霉的LOD分别为250、41和97 ng/mL。

离体模型验证

在真菌性角膜炎的离体猪角膜模型中，共评估65份角膜刮取物标本，包括白色念珠菌（n=7）、黄曲霉（n=19）、茄病镰刀菌（n=17）、金黄色葡萄球菌（n=5）、铜绿假单胞菌（n=5）感染组及非感染对照组（n=12）。所有非感染标本均为阴性。两种LFIA分别对其目标病原体感染的标本均呈阳性，且未与异源真菌或细菌病原体发生交叉反应。

结论与意义

研究人员成功开发了一套结合次氯酸钠氧化释放甘露聚糖与LFIA检测的完整方案，实现了<20分钟、从标本到结果的即时检测（POC）流程。该方案满足世界卫生组织（WHO）推荐的ASSURED标准（可负担、灵敏、特异、用户友好、快速/稳健、无需设备、可交付），尤其适用于缺乏显微镜基础设施和专业人员资源有限的环境。其中，硫代硫酸钠因其无机性质、明确的化学中和机制、低浓度高效且安全的特点，被优选为条内中和试剂。在真菌性角膜炎这一导致全球约60万人/年永久性视力丧失的疾病中，该方案有望成为KOH镜检的有效替代诊断工具。值得注意的是，离体猪角膜模型中的真菌负荷与人角膜刮取物相似，预示其在人类患者中的潜在应用价值。未来需通过人角膜刮取物的临床研究进一步验证，并扩展至其他依赖KOH镜检的真菌感染诊断场景，如外阴阴道念珠菌病、口腔念珠菌病、甲癣及鼻眶脑毛霉病等。