《Drug Resistance Updates》：Targeting V-ATPase assembly via sEVs-delivered doxorubicin triggers methuosis and circumvents temozolomide resistance in glioblastoma
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摘要目的替莫唑胺（TMZ）耐药仍是胶质母细胞瘤（GBM）的主要挑战。溶酶体改变是否代表TMZ耐药性GBM（TR-GBM）中可利用的脆弱靶点尚不明确。本研究探讨微小细胞外囊泡（sEVs）能否重编程多柔比星（DOX）的亚细胞转运，以利用溶酶体脆弱性并绕过耐药性。方法本研究使用配对
摘要
目的
替莫唑胺（TMZ）耐药仍是胶质母细胞瘤（GBM）的主要挑战。溶酶体改变是否代表TMZ耐药性GBM（TR-GBM）中可利用的脆弱靶点尚不明确。本研究探讨微小细胞外囊泡（sEVs）能否重编程多柔比星（DOX）的亚细胞转运，以利用溶酶体脆弱性并绕过耐药性。
方法
本研究使用配对的初发/复发GBM组织、TR-GBM细胞系（TR-U87、TR-U251）、患者来源的异种移植瘤（PDX）及原位模型。对DOX载药sEVs（sEVs-DOX）进行了表征。通过共聚焦显微镜、细胞器染色和Percoll梯度分离评估DOX的亚细胞分布。通过共免疫沉淀、免疫荧光、溶酶体pH测量和质子泵活性评估V-ATPase的组装与功能。使用ATP6V1D过表达和敲低进行验证。
结果
TR-GBM表现出溶酶体扩张和不稳定性。sEVs-DOX将DOX重新定向至溶酶体，诱导甲醇死亡（methuosis）并绕过TMZ耐药性。机制上，溶酶体中的DOX直接与ATP6V1D结合，破坏V-ATPase组装，导致溶酶体去酸化和功能障碍。ATP6V1D过表达可挽救这些缺陷，而敲低则模拟了sEVs-DOX的效果。sEVs-DOX在皮下、原位及PDX模型中均显示出显著疗效，且毒性极低。
结论
溶酶体功能障碍是TR-GBM中可利用的脆弱靶点。sEVs-DOX通过诱导V-ATPase依赖性甲醇死亡绕过耐药性，提供了一种有前景的治疗策略。
引言
胶质母细胞瘤（GBM）是原发于脑部的恶性程度最高的肿瘤，其中位生存期极差，且在全球范围内包括中国患者队列在内的所有群体中预后均持续不佳（Qu et al., 2026）。尽管经过最大程度的手术切除、放射治疗、替莫唑胺（TMZ）化疗及基于分子靶向的治疗，五年生存率仍低于5%（Berger et al., 2022, Qu et al., 2025）。TMZ是一种DNA烷化剂，作为一线治疗药物，但其疗效几乎不可避免地因耐药性的出现而受到损害，包括依赖于O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）的或非依赖性DNA修复通路（Brandner et al., 2021, Sun et al., 2025）。虽然凋亡是TMZ诱导的主要细胞死亡方式，但耐药性往往源于凋亡信号的缺陷，因此需要针对非凋亡通路的替代策略（Overmeyer et al., 2011, Zhu et al., 2024, Cao et al., 2023）。
溶酶体日益被认为是癌症耐药性的核心枢纽。除了其经典的自噬和内吞功能外，溶酶体还可隔离弱碱性化疗药物、酸化并灭活药物，并支持促存活信号通路。值得注意的是，来自多种肿瘤类型的耐药癌细胞被报道表现出溶酶体脆弱性——包括囊泡增大和膜不稳定性——这提示如果以适当方式加以利用，溶酶体可能成为可利用的脆弱靶点（Perera et al., 2015, Ostenfeld et al., 2005）。例如，美金刚嗪（ifenprodil）已被证实通过增加溶酶体膜的通透性来诱导活性氧介导的细胞毒性，从而杀伤恶性胶质瘤细胞（Jing et al., 2022）。类似地，化合物RDN通过抑制液泡蛋白分选18（VPS18）来破坏溶酶体转运，从而逆转多西他赛耐药性（Niu et al., 2021）。然而，TMZ耐药性GBM（TR-GBM）是否获得了可被治疗利用的特异性溶酶体改变，目前很大程度上尚待探索。
目前靶向溶酶体的治疗策略在TR-GBM中收效有限。氯喹（CQ）和羟氯喹（HCQ）等药物可中和溶酶体酸性并阻断自噬通量，但其单药细胞毒性不足以对抗耐药肿瘤，联合治疗方案也仅带来了有限的临床获益（Rebecca and Amaravadi, 2016）。合成纳米药物（如pH响应性脂质体和介孔二氧化硅纳米颗粒）已被设计用于诱导溶酶体膜通透化，但它们在GBM中的应用受到血脑屏障（BBB）渗透差、被单核吞噬细胞系统快速清除以及潜在免疫原性的严重限制（Guo et al., 2022, Qiao et al., 2020, Simon et al., 2020）。这些局限性凸显了需要一种天然兼具血脑屏障穿越能力、肿瘤选择性和溶酶体靶向载药释放功能的递送平台的必要性。
微小细胞外囊泡（sEVs）是细胞分泌的天然纳米级囊泡（50–150 nm），在溶酶体靶向递送方面具有固有优势（Del Bene et al., 2022）。其富含跨膜蛋白和组织特异性黏附分子的磷脂双分子层膜，能够穿透血脑屏障并实现肿瘤选择性归巢，同时避免免疫清除（Rehman et al., 2023）。关键的是，sEVs在被细胞内化后表现出固有的溶酶体趋向性，通过内体途径转运并最终与溶酶体融合以实现载药的浓缩释放（Heusermann et al., 2016）。目前的工程化策略允许将化疗药物精确装载至sEVs中，使其成为通过重定向传统药物的亚细胞目的地来重新利用常规药物的理想平台（Xia et al., 2023）。
在本研究中，我们使用sEVs将多柔比星（DOX）——一种经典的拓扑异构酶II抑制剂，其经典作用机制为在细胞核内诱导DNA损伤和凋亡——重新定向至TR-GBM细胞的溶酶体区室。令人瞩目的是，一旦DOX在溶酶体中富集，它便完全放弃了其常规的核内活性。相反，它直接与液泡型H?-ATPase（V-ATPase）质子泵的ATP6V1D亚基结合，破坏V1-V0组装并使溶酶体电化学梯度崩溃。溶酶体功能障碍触发了甲醇死亡，其特征是灾难性的细胞质空泡化。我们的发现不仅阐明了绕过化疗耐药性的溶酶体中心机制，还开创了一种通过sEV介导的递送系统重编程传统化疗药物亚细胞定位的范式。
章节摘要
溶酶体是TMZ耐药性GBM的治疗脆弱靶点
尽管溶酶体对多种细胞过程在功能上至关重要，但在GBM获得TMZ耐药性过程中溶酶体是否发生特异性改变尚不清楚。为探究其潜在机制，我们收集了配对的初发和复发GBM组织（n=3）。根据既往研究（Guo et al., 2019），复发GBM组织表现出高MGMT表达（图S1A），证实了其耐药表型。通过检测溶酶体形态……
讨论
由sEVs递送的化疗药物展现了优异的抗肿瘤效率（Del Bene et al., 2022, Rehman et al., 2023）。然而，其潜在机制仍有待阐明。我们的研究证明，sEVs能够从根本上重编程TR-GBM细胞中DOX的亚细胞转运，将其从核DNA重定向至溶酶体。这种溶酶体富集将DOX从经典的凋亡诱导剂转变为甲醇死亡的触发剂，从而在体内绕过TMZ耐药性并……
样本采集
配对的初发和复发GBM标本采集于温州医科大学附属第一医院。初发组（n=3）未接受化疗或放射治疗，而复发组（n=3）则接受了替莫唑胺（TMZ）治疗。继发性GBM或曾接受贝伐珠单抗治疗的患者被排除在外。所有病例均经组织学确认，并归类为IDH野生型。
统计分析
统计分析使用GraphPad Prism软件（版本8.0.1）进行。数据以至少三次独立实验的均值±标准差表示。对于嵌套测量，在每个样本的技术重复平均值计算后再进行组间比较。正态性采用Shapiro–Wilk检验评估，方差齐性根据情况采用F检验、Levene检验或Brown–Forsythe检验。两组比较采用双尾非配对t检验，并使用Welch校正……
伦理审批与参与同意
所有患者均在遵循《赫尔辛基宣言》原则的方案下签署了书面知情同意书。本研究经温州医科大学附属第一医院伦理委员会批准。
未引用参考文献
（Welsh et al. (2024)）
资金资助
本研究得到浙江省自然科学基金（项目编号：LQN25H160054）、温州医科大学附属第一医院博士科研基金（2022QD063）、温州医科大学肿瘤学科群（z2-2023016）以及浙江省卫生厅一般科研项目（项目编号：2023KY888）的资助。
CRediT作者贡献声明
卢江龙：资源。蔡琳：资源。杨士镇：软件。李群：资源。代长安：资源。曾波：资源。唐润华：初稿撰写、资源、形式化分析、数据整理。苏志鹏：审阅与编辑、项目管理、概念构思。刘越：资源。吴立豪：方法学、概念构思。杨怡：资源。许帆杰：资源。王显鹏：方法学。郭玉航：审阅与编辑、初稿撰写……
致谢
无
利益冲突声明
作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
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