基于wzi分子条形码的扩增子测序技术揭示肺炎克雷伯菌单一定植与感染风险显著关联

《mSphere》：A novel technique to characterize Klebsiella pneumoniae populations indicates that mono-colonization is associated with risk of infection

　　

： 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）及相关物种是医疗保健相关感染的常见病原体。肠道是克雷伯菌的主要储库，肠道定植是发生肠外克雷伯菌感染的危险因素。患者肠道可同时被多种克雷伯菌菌株甚至多个物种定植，且肠道定植菌株与引起感染的菌株之间具有高度一致性。定植菌株的检测与特征分析对于更好地理解感染进展过程以及为定植患者制定干预措施至关重要。然而，混合定植或单一定植与后续感染之间的关联尚不明确。在本研究中，研究人员开发了一种名为wzi-Seq的基于扩增子的测序方法，利用保守的荚膜基因wzi作为分子条形码，能够从复杂样本和混合物中检测并定量克雷伯菌菌株。该方法具有高度准确性和精确性，在包含多达58种独特wzi类型的混合物中灵敏度为93%，特异性为99.8%，并且与来自既定病例对照队列的存档直肠拭子样本的基于培养的检测结果具有90.8%的一致性。结合培养数据对wzi-Seq结果进行判定，研究人员确定63.2%（108/171）的患者为单一克雷伯菌菌株定植（单一定植），而36.8%（63/171）的患者存在多种克雷伯菌菌株的混合定植。在多变量分析中控制患者变量后，研究人员确定单一定植与感染显著相关（P = 0.034）。对克雷伯菌定植群体的特征分析可提高感染风险评估的准确性，并为预防这些医疗保健相关感染提供靶向干预措施。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）已成为全球关注的重大病原体，其毒力和抗生素耐药性持续上升，目前是全球抗菌药物耐药相关死亡原因的第三大贡献者。Kp属于一个由五个密切相关的物种及其亚种组成的物种复合群（KpSC），包括肺炎克雷伯菌、K. variicola、K. quasipneumoniae、K. quasivariicola和K. africana。这些物种可定植于鼻咽部和肠道等黏膜表面，并可引起肺炎、尿路感染和菌血症。肠道是Kp的主要储库，无症状肠道定植率通常在6%至23%之间。Kp肠道定植是发生肠外Kp感染的主要危险因素，约80%的患者中，肠道定植菌株与引起感染的菌株具有一致性。

然而，现有的定植数据通常基于每位患者少数几个培养分离株，无法清晰了解患者体内定植Kp的动态变化。即使在这种有限采样条件下，研究人员偶尔也观察到患者同时被多种菌株定植。混合定植的真实发生率及其对感染风险的影响是知识领域的重大空白。混合定植可能代表一种低风险状态，即菌株之间及与更大微生物群落的共生关系阻止了疾病进展；也可能代表一种极度菌群失调状态，即生态位排斥受损，多种致病性Kp菌株侵入并增加感染风险。因此，准确检测和表征定植菌株对于理解感染进展和制定干预措施至关重要。

二、研究目的与创新方法

为更好地表征Kp定植动态及其对患者感染风险的影响，研究人员开发了一种名为wzi-Seq的高通量、高精度扩增子测序方法。该方法利用Kp荚膜操纵子中保守的wzi基因作为分子条形码，wzi基因包含一个高度可变的447 bp区域，此前已验证的wzi引物可扩增该区域侧翼的保守基序。Sanger测序已建立了包含741种独特wzi类型的BigsDB数据库，wzi分型具有比传统K血清分型更高的分辨力，与MLST分型的分辨力相当。

wzi-Seq方法的核心流程包括：从样本中提取DNA，进行wzi基因PCR扩增生成581 bp扩增子，通过纳米孔测序（Nanopore sequencing）进行长读长测序，经过碱基识别和质量控制后，将读段比对至741种已知wzi类型参考序列数据库，从而计算样本中每种wzi类型的丰度。研究采用了两种质量控制流程：error0流程不允许任何错配，更为严格；error0.005流程允许比对长度0.5%的错配率，预期产生更多读段用于丰度定量。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：（1）wzi-Seq扩增子测序技术，以wzi基因作为分子条形码，结合纳米孔长读长测序实现对复杂样本中多种Kp菌株的检测和定量；（2）ROC曲线分析确定菌株检测的最佳读段比例阈值；（3）对来自既往病例对照队列的236份存档直肠拭子样本进行wzi-Seq分析，该队列中病例为发生肠外感染的患者，对照组为未感染者；（4）采用16S rRNA基因测序分析肠道微生物群落结构；（5）使用正交验证方法包括重复wzi-Seq分析和直接Illumina测序；（6）多变量逻辑回归模型评估单一定植与感染的独立关联。

四、研究结果

wzi-Seq检测方法的准确性与精确性。 对单一Kp菌株KPPR1（wzi类型2）测序获得13,367条（error0.005流程）和6,181条（error0流程）读段，两种流程的读段准确率均大于99.7%。在5种wzi类型混合物中，error0.005流程的平均丰度与预期丰度偏差在1%以内，重复间标准差小于1%。在包含12至58种独特wzi类型的复杂混合物中，读段准确率均大于99%，各wzi类型的丰度定量在两种流程间无显著差异。额外进行第二轮PCR扩增不影响丰度定量的准确性和精确性。

菌株检测的灵敏度与特异性。 利用23个复杂度从5到58种wzi类型不等的人为混合样本生成ROC曲线，error0.005流程的ROC曲线下面积为0.9925，error0流程为0.9986。采用readfrac截断值0.00275（error0.005流程）时，预测灵敏度为93.0%，特异性为99.8%；采用readfrac截断值0.00172（error0流程）时，预测灵敏度为94.2%，特异性为100%。在37株菌株混合物掺入含内源性克雷伯菌的人类粪便样本的实验中，所有37株菌均被检测到，平均读段准确率为98.8%。

存档患者样本验证。 对236份直肠拭子样本进行wzi-Seq分析，其中166份（70.3%）需要第二轮PCR以满足测序DNA投入要求。27份（11.4%）PCR失败，8份（3.4%）测序读段不足，最终201份样本纳入分析。在具有单分离株wzi分型数据的195份样本中，wzi-Seq在177份（90.8%）中检测到至少一种已知wzi类型。

克雷伯菌定植动态调查。 经严格质量控制后，171份（72.5%）样本纳入最终分析。其中108/171（63.2%）为单一wzi类型定植，63/171（36.8%）为混合定植，含2至7种wzi类型。相比之下，传统培养和3个分离株wzi分型仅检出5/171（2.9%）为混合定植。大多数混合定植样本（79.4%）含2或3种wzi类型。在混合定植样本中，92.1%（58/63）的最优势wzi类型丰度超过50%，66.7%（42/63）超过75%，表明即使混合定植也往往由一种菌株主导。混合定植样本中共检出119种独特wzi类型，具有高度多样性。

混合与单一定植状态的验证。 对8份拭子样本（4份混合定植、4份单一定植）进行重复wzi-Seq分析和直接Illumina测序，结果与原始分析高度一致，所有error0.005检测的wzi类型均被确认，混合与单一定植分类完全一致。针对大肠杆菌（E. coli）可能携带克雷伯菌样荚膜并干扰检测的问题，研究人员将E. coli wzi序列加入参考数据库后重新分析，63份混合定植样本中62份（98.4%）仍被分类为混合定植。

单一定植与感染风险的关联。 在171份直肠拭子中，66份来自后续发生克雷伯菌感染的定植患者（病例），105份来自无症状定植对照。混合定植在对照组（45/105，43%）比病例组（18/66，27%）更常见。多变量逻辑回归模型调整年龄、性别、采样月份、既往导尿管使用和基线血清白蛋白后，单一定植与后续感染独立相关，感染几率增加2.18倍（95% CI 1.08–4.57，P = 0.034）。

肠道群落结构与定植状态。 16S rRNA基因测序分析显示，单一定植与混合定植患者之间的肠道微生物群落结构无显著差异，包括α多样性（Chao、inverse Simpson、Shannon指数）和β多样性均无显著差异。基于ASV的克雷伯菌丰度在单一定植样本中呈升高趋势，但未达到统计学显著水平。

五、讨论与结论

本研究开发并验证了wzi-Seq这一新型扩增子测序方法，可直接从样本中进行菌株分型，区别于需要培养单分离株的WGS、MLST、PFGE和MALDI-TOF等方法。该方法在包含多达58种菌株的复杂混合物中具有93%/99.8%（error0.005流程）和94.21%/100%（error0流程）的灵敏度/特异性。

研究发现混合定植在相当比例的患者中存在，但单一定植与感染风险增加相关。这与艰难梭菌（Clostridioides difficile）的情况不同——后者混合感染与复发显著相关（OR 3.5）。对于克雷伯菌，KpSC内的混合定植可能代表一种更接近共生状态的情况，菌株间可能存在交叉喂养等互惠关系，使菌株间相互制约从而降低致病机会。单一定植则与更高的Kp相对丰度相关，可能代表某一种Kp菌株在肠道群落中的优势扩增，完全取代了其他菌株。即使在混合定植中，也往往有一种wzi类型占主导，提示Kp菌株间存在竞争性排斥。

肠道微生物群落结构在单一与混合定植患者间无显著差异，提示其他临床和环境因素可能在塑造整体群落结构中发挥更重要作用，或者Kp菌株可能占据特定的生态位而不引起群落结构的显著变化。

本研究存在一些局限性：wzi-Seq依赖单一保守基因，无法区分相同wzi类型内的不同菌株；引物靶向KpSC而非亲缘关系较远的物种如K. oxytoca；少数情况下引物可扩增1组E. coli wzi基因，但通过将E. coli wzi序列纳入参考数据库并要求100%匹配来部分解决。1%的检测截断值较为保守，可能导致含低丰度第二菌株的样本被分类为单一定植。

综上所述，本研究描述了wzi-Seq这一新型技术的开发和验证，该技术能够从复杂样本中检测和定量Kp。研究揭示了肠道定植群体结构影响医疗保健相关感染风险，单一定植患者感染风险显著升高。未来该技术可应用于患者样本检测、扩展靶向其他基因，以及在实验和自然条件下表征Kp的多样化群体。