雄性大鼠α-松油醇暴露后Kiss1-Gnrh1及睾丸类固醇生成基因表达的变化

《Food and Chemical Toxicology》：Alterations in Kiss1-Gnrh1 and Testicular Steroidogenic Gene Expression Following α-Terpineol Exposure in Male Rats

　　

## 摘要

本研究探讨了反复口服α-松油醇暴露是否与Kiss1-GnRH相关的下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴信号通路改变及睾丸类固醇生成障碍有关，研究动物为雄性Sprague-Dawley大鼠。成年雄性大鼠经口灌胃给予α-T（75、150或300 mg/kg/天），持续28天。评估了生殖激素水平、精子特征、器官重量、睾丸组织病理学和超微结构、氧化应激生物标志物、DNA损伤、Nrf2免疫反应性，以及参与HPG轴调控和类固醇生成的基因表达。反复α-T暴露与剂量依赖性生殖毒性相关，表现为生殖器官重量显著降低、循环中GnRH、LH、FSH及睾酮水平下降、精子数量减少、活力和存活率受损、精子异常率升高，以及睾丸组织病理学和线粒体超微结构显著改变。α-T暴露与氧化应激相关，表现为脂质过氧化（MDA）增加、抗氧化防御（SOD、CAT、GSH）耗竭、Nrf2免疫反应性增强以及睾丸DNA损伤增加。分子分析显示Kiss1、Gnrh1、Lhb、Star、Hsd3b和Cyp11a1显著下调，同时与GnRH信号传导、类固醇生成和生殖内分泌调控相关的通路富集。综合以上发现，本研究证明了反复α-松油醇暴露导致的雄性生殖毒性，并鉴定了伴随的Kiss1-GnRH相关、类固醇生成及氧化应激终点的变化；然而，这些通路的因果贡献仍有待确立。

## 引言

α-松油醇（α-T）是一种天然存在的单环单萜类叔醇，是包括松属、白千层属、柑橘属和牛至属在内的多种芳香植物精油的主要成分（Chen等，2023；Khaleel等，2018；Sales等，2020）。由于其愉悦的丁香花香气和优良的理化性质（Bhatia等，2008；Chen等，2023），α-T得到了广泛应用。除工业应用外，α-T因其多样的生物活性——包括抗氧化、抗炎、抗菌、镇痛、神经保护和抗癌特性——引起了广泛关注（Bicas等，2011；Chinnappan等，2025；Hassan等，2010；Held等，2007；Soleimani等，2019）。因此，人类通过职业环境、药物制剂和消费产品接触α-T的程度大幅增加。尽管其有益性质已被公认，但最近的毒理学研究表明，反复α-T暴露可诱导氧化应激、炎症、DNA损伤和生殖毒性，表明其毒理学特征——尤其是关于慢性暴露和生殖健康效应方面——尚未得到充分表征（Goravara和Malashetty，2025；Hegde和Malashetty，2024）。

虽然遗传异常和内分泌障碍是男性不育的贡献因素，但越来越多的证据表明环境化学物质是导致生殖健康受损的潜在因素（Lahimer等，2023）。许多环境有毒物质作为内分泌干扰化学物质（EDCs），通过多种分子机制干扰激素稳态、精子发生和类固醇生成（Diamanti-Kandarakis等，2009；Falvo等，2026；Gore等，2015）。

正常的雄性生殖功能通过严格调控的下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴来维持。Kisspeptin由Kiss1基因编码，被认为是促性腺激素释放激素（GnRH）神经元的上游关键调节因子，在生殖内分泌调控中发挥重要作用（De Tassigny和Colledge，2010；Pinilla等，2012）。GnRH的脉冲式分泌刺激腺垂体促性腺细胞释放黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH），后者调节Leydig细胞和Sertoli细胞功能、睾酮产生及精子发生（Marques等，2024；Oduwole等，2018）。睾酮合成依赖于多种类固醇生成蛋白的协调表达，包括类固醇生成急性调节蛋白（StAR）、胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）和3β-羟基类固醇脱氢酶（HSD3B），这些蛋白介导胆固醇转运和雄激素生物合成的逐步酶促反应。这些内分泌通路的破坏可降低睾酮产生、损害精子发生，并最终损害男性生育力（Flück等，2026；LaVoie和King，2009；Miller和Auchus，2011；Ye等，2011）。

氧化应激被广泛认为是化学物质诱导生殖毒性的主要机制之一（Darbandi等，2018）。在生理条件下，活性氧（ROS）在精子获能、超活化及顶体反应中发挥关键作用。然而，过量ROS的产生会压倒内源性抗氧化防御系统，导致脂质过氧化、蛋白质氧化、线粒体功能障碍和DNA损伤（Agarwal等，2014；Bisht等，2017）。由于精子富含多不饱和脂肪酸、胞质抗氧化防御有限且DNA修复能力较弱，因此特别容易受到氧化损伤（Wang等，2025）。因此，持续性氧化应激与精子数量减少、活力下降、形态异常、DNA碎片化增加及受精能力降低相关，这在人类和实验动物模型中均有报道（Appasamy等，2007；Hussain等，2023）。

越来越多的证据表明，氧化应激不仅直接损伤精子，还通过抑制下丘脑GnRH分泌、改变垂体促性腺激素释放和损害睾丸类固醇生成来扰乱内分泌调控，从而破坏下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴（Darbandi等，2018；Rotimi等，2024）。在氧化应激反应中，核因子红系细胞相关因子2（Nrf2）信号通路作为对抗氧化损伤的主要细胞防御机制。在基础条件下，Nrf2被Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）隔离在胞质中（Baird和Yamamoto，2020）。在氧化应激条件下，Nrf2与KEAP1解离，转位至细胞核，并与抗氧化反应元件（AREs）结合，从而诱导抗氧化和细胞保护基因的表达，维持细胞氧化还原稳态（Verza等，2025；Zhang等，2025）。尽管Nrf2通路的短暂激活具有细胞保护作用，但持续性或过度的氧化应激可压倒这一适应性反应，导致线粒体功能障碍、类固醇生成受损、生殖细胞退变，最终导致生殖功能异常（Holmstr?m等，2016；Liu等，2025）。

尽管最近的实验研究表明反复α-T暴露可诱导氧化应激和生殖毒性（Goravara和Malashetty，2025；Hegde和Malashetty，2024），但其对下丘脑神经内分泌调控和睾丸类固醇生成的影响仍知之甚少。特别是，α-T是否破坏Kiss1-GnRH信号通路、改变垂体促性腺激素分泌、抑制关键类固醇生成基因（Star、Hsd3b和Cyp11a1）的表达，以及引起氧化应激、线粒体功能、DNA完整性和Nrf2介导的抗氧化反应之间的协同变化，仍有待明确。

鉴于本研究旨在阐明α-松油醇相关生殖毒性的机制，实验设计侧重于评估反复口服暴露后的剂量依赖性生物反应，而非模拟典型的人类暴露水平。因此，本研究探讨了反复口服α-松油醇暴露是否与Kiss1-GnRH相关的神经内分泌信号、垂体促性腺激素调控、睾丸类固醇生成及大鼠雄性生殖功能的协同改变有关。评估了生殖激素、精子特征、睾丸组织病理学和超微结构、氧化应激生物标志物、DNA损伤、Nrf2免疫反应性，以及下丘脑-垂体-性腺轴上选定基因的表达。这些测量旨在识别通路水平的关联并建立生物学上合理的机制框架，而非证明Kiss1-GnRH通路的改变是α-松油醇诱导生殖毒性的因果介导因素。

## 化学品

测试物质α-T（C??H??O；CAS编号：98-55-5；纯度>93%）购自Suyash Ayurveda（印度古吉拉特邦）。初步溶解性测试确认α-T在玉米油（SKU：02901414-CF；MP Biomedicals）中溶解良好，玉米油作为口服给予的载体。免疫荧光分析所用试剂包括：兔多克隆抗Nrf2一抗（Abcam，英国）、Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG二抗（#A-11008，Invitrogen，美国）、DAPI。

## 一般临床体征和死亡率

在所有处理组中，整个实验期间均未观察到死亡或治疗相关的临床体征。

## 体重和食物消耗

α-T对体重和食物消耗的影响如图3A所示。所有实验组在28天给药期间体重均呈渐进性增加。给予300 mg/kg α-T的大鼠从第21天起体重增长逐渐减缓，第28天时最终体重比对照组低4.98%；然而，该差...

## 讨论

本研究评估了反复口服α-T暴露对Sprague-Dawley大鼠雄性生殖系统的影响。结果表明，α-T通过扰乱内分泌稳态、诱导氧化应激和DNA损伤、损害精子质量、改变组织结构和参与下丘脑-垂体-性腺轴调控及类固醇生成的基因表达，从而对生殖功能产生不利影响。这些结果与我们先前的...一致。

## 结论

据我们所知，本研究首次提供了整合证据，证明反复口服α-T暴露与雄性大鼠KISS1/GnRH调控的下丘脑-垂体-性腺信号抑制及睾丸类固醇生成受抑相关。α-T暴露与终末循环生殖激素浓度降低、精子质量受损、睾丸组织病理学和定性超微结构异常、氧化失衡及...相关。

## CRediT作者贡献声明

Rahul Handi：写作——审稿与编辑、验证、方法学、正式分析。Vijay A Yenagi：写作——审稿与编辑、验证、方法学、正式分析。Pakkiresha Goravara：写作——初稿、方法学、调查研究、数据整理。Vijaykumar B. Malashetty：写作——审稿与编辑、验证、监督、方法学、正式分析、概念设计。

## 未引用参考文献

Lowry等，1951；世界卫生组织，2010。

## 伦理声明

本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经Vijayanagara Sri Krishnadevaraya大学Ballari分校批准（批准号：VSKUB/ZOO/IAEC/2024-25/04）。

## 利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

## 数据可用性

数据将根据请求提供。

## 资金

本研究未获得公共、商业或非营利部门任何资助机构的专项资助。

## 竞争利益声明

? 作者声明以下经济利益/个人关系可能被视为潜在竞争利益：Vijaykumar B. Malashetty报告行政管理支持和设备、药品或耗材由印度卡纳塔克邦达哈瓦德Mental Health and Neurosciences多学科健康研究所（DIMHANS）多学科研究单位（MRU）提供。报告与该机构的关系包括：有专利申请。如有其他作者，他们声明没有已知的竞争...

## 致谢

作者感谢印度卡纳塔克邦达哈瓦德DHR资助的多学科健康研究所（DIMHANS）多学科研究单位（MRU）提供实验室设施和技术支持，使分子分析得以顺利完成。作者感谢马哈德拉瓦德ACTREC-TMC电子显微镜中心提供透射电子显微镜设施和技术支持。

Pakkiresha Goravara | Rahul M. Handi | Vijay A. Yenagi | Vijaykumar B. Malashetty