姜黄素经液体复合凝聚相选择性隔离及其肠道保护增强作用

《Food Bioscience》：Preferential curcumin sequestration by liquid complex coacervation and enhanced intestinal protection

　　

姜黄素（Curcumin，Cur）作为姜黄（Curcuma longa）的主要多酚类生物活性成分，因其抗氧化及炎症调节活性而备受关注。在实验性肠道损伤模型中，姜黄素已被证实可减轻氧化应激、上皮损伤及炎症信号传导。然而，其口服应用仍受限于极低的水溶性、在中性或碱性条件下的快速降解、有限的肠道吸收以及广泛的代谢。尽管多种脂质及颗粒类递送系统可改善姜黄素的分散性与生物可及性，但这些传统载体往往涉及多步加工、复杂多组分配方（如油相及合成乳化剂）或共价交联剂，并可能带来额外的纯化步骤及化学交联体系的潜在细胞毒性问题。复合凝聚（complex coacervation）提供了一种基于带相反电荷大分子间缔合性液-液相分离的独特途径。当直接用作载体时，所得富水、富含聚合物的液相本身并不需要表面活性剂介导的乳化或化学交联。本研究旨在将先前建立的鱼明胶-岩藻多糖复合凝聚体系（COA）拓展至姜黄素包封，并评估其肠道保护效果。为此，研究人员系统考察了姜黄素乙醇母液对水相相分离的物理影响，以确定能够维持高包封产率及清晰液滴形态的配方条件。随后评估了姜黄素负载量对包封产率及载药凝聚体（COA-Cur）流体动力学组织的影响。进一步考察了COA-Cur在暴露于果蝇饲喂基质可溶性组分蔗糖（Sucrose，Suc）及葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium，DSS）后的保留率及液滴形态。最后，在果蝇DSS诱导肠道炎症模型中比较了游离姜黄素与COA-Cur的肠道保护效果。通过综合分析生理屏障功能、运动恢复及上皮损伤的细胞标志物，本研究旨在评估源自食品的液体凝聚体相较于游离姜黄素，能否显著增强其体内保护效力及表观剂量效率。

一、研究背景与问题提出

姜黄素（Curcumin，Cur）是姜黄（Curcuma longa）中主要的酚类生物活性成分，具有抗氧化和炎症调节活性，在实验性肠道损伤模型中显示出减轻氧化应激、上皮损伤和炎症信号传导的潜力。然而，其口服应用长期受制于极低的水溶性、中性或碱性条件下的快速降解、有限的肠道吸收以及广泛的代谢转化。现有递送策略如固体脂质纳米粒、聚合物胶束和喷雾干燥制剂等，往往涉及高温熔融、共溶剂蒸发或多步脱水等复杂工艺，且部分体系依赖合成乳化剂或化学交联剂，存在纯化需求和潜在细胞毒性问题，限制了其在食品体系中作为最小化加工水相制剂的应用。

复合凝聚（complex coacervation）基于带相反电荷大分子间的缔合性液-液相分离，所得富水、富含聚合物的液相无需表面活性剂乳化或化学交联。研究人员前期已建立岩藻多糖-聚赖氨酸凝聚体用于带电荷治疗性蛋白的递送，以及鱼明胶-岩藻多糖凝聚体用于C-藻蓝蛋白的胃肠道递送。然而，将这一平台拓展至姜黄素这类小分子、非离子化、疏水性化合物面临独特挑战：姜黄素需借助乙醇（EtOH）等助溶剂实现初始溶解，而助溶剂的引入可能从热力学上扰动水相相分离。因此，系统研究助溶剂掺入对凝聚体形态和包封性能的影响，是理解其隔离机制的关键。成年果蝇中肠提供了评估制剂理化改善能否转化为实际保护效应的可操作模型，其DSS诱导损伤模型可在生物体、组织和细胞水平对游离姜黄素与制剂化姜黄素进行比较。

二、研究内容与主要结论

本研究将已建立的鱼明胶-岩藻多糖复合凝聚体系拓展至姜黄素包封。通过优化乙醇助溶剂比例，在5.0%（v/v）条件下实现了20倍姜黄素投料范围内超过92%的包封率，并保持了典型的液滴形态。COA-Cur在蔗糖和DSS等果蝇饲喂基质可溶性组分中暴露10分钟后，姜黄素保留率超过95%。在果蝇DSS诱导肠道炎症模型中，COA-Cur在75 μM浓度即产生显著的生理、结构和细胞保护效应，而游离姜黄素通常需要300 μM才能达到显著保护，表明制剂化姜黄素具有改善的表观剂量效率。该研究将食品来源液体凝聚体拓展为疏水性小分子生物活性物的最小化加工口服递送平台。

三、主要关键技术方法

研究人员采用以下关键技术方法：以鱼明胶和岩藻多糖为原料，在pH 3.3条件下通过质量比80:20诱导复合凝聚形成液体凝聚体；姜黄素以乙醇母液形式引入，考察不同助溶剂比例和投料浓度对包封的影响；采用紫外-可见分光光度法（UV/Vis）在420 nm波长测定姜黄素含量并计算包封产率；通过600 nm浊度测定、光学显微镜观察液滴形态、Zetasizer Nano ZS90测定ζ-电位及动态光散射（DLS）分析流体动力学尺寸分布；以成年果蝇（Oregon-R品系，购自Bloomington果蝇中心）为模式生物，采用含2.0% DSS的琼脂糖饲喂基质诱导肠道损伤，通过Smurf实验评估肠道屏障完整性、负向地性实验评估运动功能、肠道长度测量评估结构损伤、免疫荧光染色检测cleaved caspase-3阳性细胞评估上皮细胞死亡，并利用esg-Gal4, tub-Gal80^ts, UAS-GFP/CyO品系（esg^ts > GFP）可视化肠道干细胞和成肠细胞。

四、研究结果

4.1 姜黄素/乙醇比例对复合凝聚和姜黄素负载的影响

研究发现，姜黄素/乙醇母液比例对凝聚体分散液浊度产生非单调影响：从COA-only的0.97 ± 0.02增加至0.1%和1.0%时的1.16 ± 0.04和1.11 ± 0.04，随后在5.0%、10.0%和20.0%时分别降至0.94 ± 0.04、0.85 ± 0.03和0.81 ± 0.03。在0.1%–10.0%比例范围内，包封产率维持在94.7 ± 0.0%至98.6 ± 0.2%之间，但在20.0%时降至76.8 ± 0.7%。ζ-电位测定显示，COA为?12.4 ± 0.6 mV，加入5.0%乙醇载体后变为?7.6 ± 0.3 mV，而COA-Cur为?7.6 ± 0.7 mV，与载体匹配的COA无显著差异，表明姜黄素掺入未明显改变凝聚体表观电动电位。光学显微镜观察显示，0.1%–5.0%比例下均呈现丰富的边界清晰的圆形液滴，5.0%时液滴保持清晰且姜黄素黄色分布于整个液滴群体；10.0%时形态异质性增加，20.0%时出现更少的均匀分散液滴和明显的黄橙色姜黄素富集团簇。宏观相分离图像证实，离心后姜黄素随凝聚体富集相沉积于管底，且随着比例增加黄色逐渐加深，上清液颜色明显浅于无聚合物对照。基于5.0%比例在保持高包封效率的同时最大化姜黄素输入，后续研究固定该比例。

4.2 姜黄素母液浓度对包封产率和COA-Cur流体动力学分布的影响

在固定5.0%（v/v）姜黄素/乙醇比例下，将姜黄素母液浓度从50增加至1000 μg/mL。包封产率维持在92.5 ± 0.2%至95.0 ± 0.5%之间，随投料增加无渐进性变化，表明在20倍投料范围内可实现高包封且未达饱和。宏观相分离图像显示各浓度均产生明显的含姜黄素凝聚体富集相，上清液颜色浅于对应无聚合物对照。动态光散射分析显示，载体匹配COA和50 μg/mL COA-Cur在约0.4 μm处呈现主要强度加权峰，伴有约5.5 μm的次级峰；100 μg/mL时主峰移至约1.1–1.3 μm；250 μg/mL时出现约0.8和1.5 μm两个峰；500 μg/mL时以约1.3 μm为主；1000 μg/mL时分布拓宽至约1.1–2.0 μm。约5.5 μm的重复峰在载体匹配COA中已存在，表明该散射模式并非姜黄素负载所特有。增加姜黄素浓度主要将散射贡献从约0.4 μm重新分配至1–2 μm范围。

4.3 蔗糖和DSS对COA-Cur姜黄素保留率和形态的影响

将COA-Cur与无琼脂糖基质混合，基质含无添加剂、2.5%蔗糖、5.0%蔗糖或5.0%蔗糖加2.0% DSS，以10:90、20:80和40:60比例获得最终姜黄素浓度75、150和300 μM。所有条件下包封效率均高于95%。添加2.5%或5.0%蔗糖仅产生较小的绝对变化，包封效率约95.6%至98.5%。含DSS基质在COA-Cur 150和300 μM时产生最低包封效率，分别为95.6 ± 0.2%和96.1 ± 0.1%。光学显微镜观察COA-Cur75显示，无添加剂、5.0%蔗糖和5.0%蔗糖/2.0% DSS条件下均保持丰富的圆形液滴，蔗糖未引起明显形态变化，DSS条件下液滴边界清晰但连续相黄色略加深，与保留率小幅下降一致。

4.4 COA-Cur在果蝇中以低于游离姜黄素的浓度缓解DSS诱导的肠道功能障碍

在2.0% DSS暴露的果蝇中，以75、150和300 μM最终姜黄素浓度比较游离姜黄素和COA-Cur的肠道保护效果。Smurf实验显示，对照组和COA组Smurf阳性果蝇可忽略不计，DSS处理显著增加Smurf阳性比例。COA-Cur在75、150和300 μM均产生显著降低，而游离姜黄素需300 μM才产生显著保护。攀爬实验显示，DSS显著损害运动能力，游离姜黄素仅在300 μM时产生显著恢复，COA-Cur在三个浓度均改善攀爬能力。肠道长度测量显示，游离姜黄素75 μM未显著恢复肠道长度，300 μM游离姜黄素和COA-Cur 75均产生显著恢复。esg-GFP分析显示，DSS显著增加肠道祖细胞反应，85%的DSS处理肠道呈现严重表型；75 μM游离姜黄素处理后严重表型仍占71%，300 μM游离姜黄素降至9%，COA-Cur 75降至17%。定量分析显示，300 μM游离姜黄素和COA-Cur 75均显著降低esg-GFP阳性细胞百分比。cleaved caspase-3染色显示，DSS增加上皮细胞死亡，游离姜黄素75 μM未显著减少，而300 μM游离姜黄素和COA-Cur 75均显著减少cCaspase-3阳性细胞数。

五、讨论与结论

在屏障功能、运动能力、结构完整性、祖细胞反应和细胞死亡等多个终点上，COA-Cur在75 μM即产生显著保护效应，而游离姜黄素的显著效应主要出现在较高的300 μM浓度，支持制剂相关的表观剂量效率改善。COA-Cur作为未交联、富水的液相，通过水相复合凝聚生成，在20倍投料范围内维持高姜黄素隔离，且在蔗糖和DSS暴露后保留率超过95%，表明姜黄素在饲喂相关水相条件下仍与聚合物富集相保持结合。液体凝聚体体系的低界面能和润湿行为为可能的肠道表面接触和局部姜黄素可利用性提供了理化依据。研究结论指出，该研究成功将鱼明胶-岩藻多糖液体复合凝聚体从带电荷大分子拓展至难溶性非离子化小分子姜黄素。通过优化乙醇助溶剂比例（5.0%，v/v），配方在20倍投料范围内实现高包封效率（>92%），并在暴露于蔗糖和DSS后保持特征性液滴形态及超过95%的姜黄素保留率。COA-Cur在75 μM即产生显著的生理、结构和细胞保护效应，而游离姜黄素通常需要更高浓度，支持COA-Cur配方的表观剂量效率改善。姜黄素在聚合物富集相中的优先保留及可能的润湿介导的肠道表面接触可能有助于摄入后的局部姜黄素可利用性。该研究将食品来源液体凝聚体拓展为疏水性小分子生物活性物的最小化加工口服递送平台。