《Free Radical Biology and Medicine》：Transient but not sustained p53 activation by targeting METTL3 prevents radiation-induced intestinal injury through dual-regulation of revival stem cells
编辑推荐：
•辐射诱导肠道中p53的主要负调控因子MDM2的表达。•辐射通过METTL3/m6A/IGF2BP3轴诱导肠道MDM2的表达。•单次METTL3抑制剂SAH给药通过激活YAP并促进revSCs再生，引起p53短暂激活，从而对抗放射性肠道损伤（RIII）。•多剂SAH给药引起p
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辐射诱导肠道中p53的主要负调控因子MDM2的表达。
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辐射通过METTL3/m6A/IGF2BP3轴诱导肠道MDM2的表达。
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单次METTL3抑制剂SAH给药通过激活YAP并促进revSCs再生，引起p53短暂激活，从而对抗放射性肠道损伤（RIII）。
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多剂SAH给药引起p53持续激活，通过YAP激活和revSCs再生未能预防RIII。
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单次SAH给药引起的p53短暂激活不改变结直肠癌的放射敏感性。
引言
肠道对辐射高度敏感，腹部和盆腔恶性肿瘤的放射治疗（RT）不可避免地会使肠道组织暴露于辐射中。这导致高达80%的患者出现急性放射性肠道损伤（RIII），而其中近半数患者会发展为慢性RIII [1]、[2]、[3]。急性RIII限制了辐射剂量并常导致治疗中断，而慢性RIII严重损害长期生活质量 [2]、[3]。尽管已开发出多种策略，氨磷汀是唯一获临床批准的辐射防护剂，但其对RIII的疗效有限。目前的管理手段仍以对症支持为主，缺乏基于机制的治疗方法 [4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]，亟需阐明RIII的发病机制并鉴定创新性治疗靶点。
作为基因组的守护者，p53调控细胞的辐射反应，并作为RIII的关键决定因素 [10]、[11]、[12]。p53基因敲除加重RIII，而其扩增则赋予保护作用 [13]，从而确立了p53激活作为潜在保护策略 [14]、[15]。由于直接靶向p53仍然困难，目前策略主要集中在阻断p53-MDM2相互作用。p53的表达受与MDM2的负反馈环路严格调控，MDM2通过转录抑制和泛素化抑制p53，而破坏MDM2-p53轴可增强肠道p53活性并减轻RIII [16]。然而，MDM2-p53抑制剂的临床转化仍然具有挑战性 [17]，凸显了激活p53的新型上游靶点的迫切需求。除了表达水平外，p53激活动态也关键决定其下游功能结局 [18]。据报道，受照射器官表现出两种主要的p53激活动态：短暂性和持续性。短暂的p53激活赋予放射抗性，而持续激活则促进放射敏感性 [18]、[19]、[20]、[21]、[22]。然而，p53激活动态对RIII的影响和机制尚不清楚。
N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最普遍的mRNA修饰之一，在辐射损伤发病机制中发挥重要作用，也是开发辐射防护剂的一个热门靶点 [23]。m6A机制包括"写入"甲基转移酶（METTL3、METTL14和WTAP）、"擦除"去甲基化酶（FTO和ALKBH5）以及"读取"蛋白质（YTHDC和IGF2BP），它们解码甲基化信号并指导RNA命运 [23]。尽管m6A在辐射诱导的肺、肝和造血损伤中的关键作用已得到确立 [24]、[25]、[26]、[27]，但m6A在RIII中调控p53的机制尚不清楚，有待进一步研究。
肠道干细胞由两大类组成：活跃（增殖性）干细胞和储备（静息性）干细胞。肠道上皮稳态由增殖性Lgr5+隐窝基底柱状细胞（CBCs）维持，这些细胞能够自我更新并分化为所有分化的谱系 [28]、[29]。这些CBCs对辐射高度敏感，可被辐射迅速耗竭，而再生则由抗辐射的储备干细胞（RSCs）介导 [28]、[29]。最近的研究鉴定了一种新型Clu+RSCs亚群，称为再生干细胞（revSCs），它们具有多能性，能够通过分化为Lgr5+CBCs再生整个上皮 [30]。有趣的是，p53的遗传性敲除可阻止辐射诱导的revSCs，凸显了其在肠道再生中的重要作用，表明p53在损伤后驱动revSCs扩增，这一机制有待进一步研究 [31]。
本研究观察到辐射通过METTL3介导的m6A修饰和IGF2BP3介导的mRNA稳定化上调肠道MDM2。功能上，单次METTL3抑制剂SAH给药抑制MDM2，诱导p53短暂激活并减轻RIII，而多剂给药引起p53持续激活却无保护作用。机制上，短暂的p53激活通过刺激YAP信号通路和revSCs再生来对抗RIII，而持续激活则不能。总之，我们的发现阐明了m6A依赖性机制在RIII中调控p53，鉴定了新的治疗靶点，并揭示了p53动态对RIII发病机制的差异性影响。
章节摘要
伦理声明与动物
8周龄雄性C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司（中国），饲养于苏州大学动物中心的无特定病原体（SPF）条件下。动物在12小时光照：黑暗周期下自由饮水和进食。所有程序均遵循苏州大学动物伦理委员会批准的指南（方案号：SUDA202310A0542）。
肠道类器官分离
肠道类器官的分离和处理如前所述 [6]。类器官维持在
辐射方案
辐射处理如前所述 [4]。对于SAH处理，小鼠在辐射前1小时腹腔注射SAH（10 mg/kg）。小鼠麻醉后，使用X-RAD 320iX辐射器以1.0 Gy/min的剂量率接受14 Gy腹腔照射。HIEC-6细胞使用同一系统以1.1 Gy/min的剂量率进行照射。
RIP
对数生长期的细胞在冰上加入RIP裂解缓冲液中裂解30分钟。离心后，上清液分为Input组和IP组。蛋白质A/G磁珠经洗涤后，在室温下与目标抗体或同型IgG偶联1小时。洗涤后的抗体-磁珠复合物在4°C下与IP裂解物孵育4小时，Input组加入裂解缓冲液。孵育后，磁珠依次用低盐缓冲液、高盐缓冲液和RIPA缓冲液洗涤。从
辐射通过升高肠道MDM2的m6A修饰和表达来抑制p53
我们首先使用全腹照射（WAI）诱导的小鼠模型 [4] 研究m6A在RIII中的作用。我们之前的数据显示，全腹照射后肠道m6A水平在6小时达到峰值，因此选择该时间点进行进一步分析。对RIII组和对照小鼠肠道进行MeRIP-seq和RNA-seq测序（图1A）。主成分分析（PCA）显示两组之间存在明显分离（图1B），表明WAI诱导了m6A修饰和RNA丰度的改变。转录组测序
讨论
本研究通过多组学测序揭示了RIII小鼠模型肠道中MDM2的m6A修饰和表达上调。我们证明辐射诱导的METTL3增强MDM2 mRNA上的m6A修饰，招募IGF2BP3稳定MDM2转录本并抑制p53。体内实验中，单次METTL3抑制剂给药短暂激活p53，并通过调节YAP信号通路和revSCs减轻RIII。相反，重复抑制剂给药导致p53持续
结论
总之，我们鉴定了METTL3/m6A/IGF2BP3/MDM2轴作为肠道p53信号通路的一种新的负调控因子，并证明通过药物抑制METTL3引起的短暂（而非持续）p53激活，通过YAP介导的revSCs再生对RIII具有选择性辐射保护作用。
作者贡献声明（CRediT）
刘承志：调查研究，数据管理。李明悦：方法学，调查研究，数据管理，概念构思。朱瑞秋：方法学，调查研究，形式分析，数据管理，概念构思。蔡尚：撰写-审阅与编辑，撰写-初稿，监督，方法学，经费获取，形式分析，概念构思。谢利伟：撰写-审阅与编辑，撰写-初稿，监督，资源。田野：撰写-初稿，资源，经费获取
伦理声明
本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究获得苏州大学伦理委员会批准。
资助
本研究获得以下基金资助：苏州大学苏州医学院青年医师科学家项目（ML12300723）、333培养项目（蔡尚）、国家自然科学基金委（82574017、82404188）、江苏省研究项目（JSTJ-2024-113、JSDW202236、JSTJ-2025-833）、苏州大学（GZK1202405、MA12300123）、苏州（GSWS2021025、Szlcyxzx202103、SKY2022167、DZXYJ202304）、苏州大学附属第二医院（
利益冲突声明
作者声明不存在已知的可能影响本文所述工作的竞争性经济利益关系或个人关系。
朱瑞秋|李明悦|刘承志|孔德富|钱佳璐|李明|田野|谢利伟|蔡尚
