宿主诱导的基因沉默介导玉米籽粒中黄曲霉毒素污染的削减

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Reduction of aflatoxin contamination in maize kernels mediated by host-induced gene silencing

　　

摘要专业翻译 黄曲霉毒素是由某些曲霉属（Aspergillus）物种产生的毒素，对全球食品安全构成重大威胁，因为它们会污染包括玉米在内的多种作物。在本研究中，研究人员利用宿主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing, HIGS）来减少玉米在感染黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）后黄曲霉毒素的积累。研究人员设计并导入了两种RNA干扰（RNA interference, RNAi）构建体至玉米中，一种靶向参与麦角固醇生物合成的两个必需真菌基因（CYP51A 和 CYP51B），另一种靶向三个黄曲霉毒素生物合成基因（AflC、AflD 和 AflR）。分别在17个和14个独立转化株系中确认了携带 CYP51A/CYP51B RNAi构建体和 AflC/AflD/AflR RNAi构建体的存在。大多数转基因株系为单一位点整合，且转基因拷贝数为一或两份。转基因的表达水平在不同株系间差异显著。小RNA测序（small RNA sequencing）证实了HIGS触发序列可产生小干扰RNA（small interfering RNAs, siRNAs）。在转基因玉米感染后，曲霉属物种中的 CYP51A、AflC、AflD 和 AflR 转录本水平均成功降低。然而，CYP51B 转录本水平未实现显著降低，且 CYP51A/CYP51B RNAi转基因对受感染玉米中的真菌生长无明显影响。相比之下，研究人员观察到四个感染黄曲霉的 AflC/AflD/AflR RNAi转基因株系以及两个感染寄生曲霉的转基因株系中黄曲霉毒素积累显著减少。值得注意的是，其中一个 AflC/AflD/AflR 转基因株系在籽粒受寄生曲霉感染时表现出极低的黄曲霉毒素污染水平。这些结果表明HIGS在减少成熟玉米籽粒中黄曲霉毒素产生方面具有潜力。

论文解读

一、研究背景与目的

黄曲霉毒素是由曲霉属（Aspergillus）黄曲霉（A. flavus）和寄生曲霉（A. parasiticus）等产生的剧毒次级代谢产物。据估计，全球每年超过25%的食品和饲料供应受到黄曲霉毒素污染，导致近45亿人长期暴露于该毒素。急性暴露可致人死亡，慢性暴露则与肝癌、致突变性及免疫抑制相关疾病有关，包括增加HIV易感性、不良出生结局以及儿童体格和认知发育迟缓。玉米作为全球广泛种植的主要粮食作物，特别容易受到黄曲霉毒素污染。目前采用的综合治理策略包括良好农业规范、作物轮作、灌溉、低感品种、非产毒曲霉生物防治、及时收获、快速干燥、气密储存、常规筛查以及臭氧处理、氨处理、辐照或饲料吸附剂等脱毒方法，但这些措施在有效性、成本和潜在环境影响方面均存在局限。因此，亟需开发新的策略来防止玉米中黄曲霉毒素的积累。

宿主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing, HIGS）是一种有前景的植物病害防控方法，利用植物固有的调控机制抑制病原体生存关键基因的表达。以往研究已在转基因花生和发育中的玉米籽粒中成功应用HIGS沉默黄曲霉的多个黄曲霉毒素生物合成基因，但缺乏针对成熟玉米籽粒感染和黄曲霉毒素积累的HIGS有效性数据，而成熟籽粒在食品和饲料供应链储存过程中是黄曲霉毒素污染的重要来源。本研究旨在探讨HIGS作为减少成熟玉米籽粒感染黄曲霉和寄生曲霉后黄曲霉毒素污染的策略，这两种真菌产生不同类型的黄曲霉毒素。

二、主要关键技术方法

研究人员选取两组基因作为RNAi靶标：一组为编码细胞色素P450羊毛甾醇C-14α-脱甲基酶（麦角固醇生物合成的关键酶，也是唑类杀菌剂的靶标）的旁系同源基因 CYP51A 和 CYP51B；另一组为黄曲霉毒素生物合成基因簇中的三个关键基因 AflC（编码聚酮合酶，催化黄曲霉毒素第一个稳定前体去甲氧基疣青霉素的初始合成）、AflD（编码酮还原酶，催化去甲氧基疣青霉素向averantin的转化）和 AflR（编码黄曲霉毒素生物合成的全局调控转录因子）。研究人员从寄生曲霉中扩增了与黄曲霉和寄生曲霉间差异仅2、4、1、2和2个核苷酸的保守RNAi触发序列，分别构建了两个发夹RNAi构建体pMCG1005_CYP51A/CYP51B和pMCG1005_AflC/AflD/AflR，通过农杆菌介导的转化导入玉米未成熟胚。共获得来自35个独立整合事件的120株T₁代转基因植株，其中71株来自20个 CYP51A/CYP51B RNAi构建体独立事件，49株来自15个 AflC/AflD/AflR RNAi构建体独立事件。后续通过除草剂筛选、PCR确认、SYBR Green定量PCR（qPCR）鉴定纯合株系和拷贝数，以及qRT-PCR量化转基因表达水平。小RNA测序用于确认siRNA的产生。黄曲霉毒素含量采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测。

三、研究结果

RNAi靶标基因与触发序列的选择。 研究人员选取了 CYP51A/CYP51B 和 AflC/AflD/AflR 两组基因作为靶标，设计了长度分别为350 bp和250 bp的保守触发序列，构建了两个发夹RNAi构建体。

RNAi转基因玉米植株的生成与分离分析。 共获得120株T₁代转基因植株。所有T₁植株去雄后用非转基因B104花粉授粉。T₁F₁后代经除草剂草铵膦喷施区分转基因植株与无效分离株，34个事件的分离比例符合单一位点整合的1:1预期，1个株系符合3:1比例。PCR确认17个 CYP51A/CYP51B RNAi整合事件和14个 AflC/AflD/AflR RNAi整合事件同时含有RNAi发夹转基因和 bar 基因。T₁F₂代除一个事件外均符合3:1分离比例。

纯合转基因植株鉴定与拷贝数估计。 基于SYBR Green的qPCR用于鉴定纯合T₁F₂转基因植株，共鉴定出159株纯合植株。经T₁F₃代验证，132个株系确认为真正纯合，27个株系被qPCR误判。大多数转基因植株携带一至两份RNAi转基因拷贝。最终获得58个 CYP51A/CYP51B RNAi纯合株系和74个 AflC/AflD/AflR RNAi纯合株系。

RNAi转基因表达水平的量化。 通过qRT-PCR检测31个转基因株系中发夹RNA的表达水平，不同株系间表达差异显著，部分株系表达量达到 GAPDH 的两倍。在不同籽粒成熟阶段，转基因表达水平无一致趋势。

靶基因的成功沉默。 在感染黄曲霉的17个 CYP51A/CYP51B 转基因株系中，8个株系中 CYP51A 转录本水平显著降低；在感染寄生曲霉的2个株系中也观察到 CYP51A 降低。但 CYP51B 转录本水平在所有转基因株系中均与对照相似。在14个 AflC/AflD/AflR 转基因株系中，8个株系在感染黄曲霉和/或寄生曲霉时表现出显著的基因沉默。总体上，两种RNAi构建体在黄曲霉中的沉默效果比寄生曲霉更明显。

CYP51A/CYP51B RNAi对真菌生长无抑制作用。 对半成熟和成熟籽粒及穗轴接种黄曲霉或寄生曲霉后，在3和6天接种后观察真菌菌丝生长和产孢情况，转基因籽粒与对照相比真菌生长无差异。这很可能是因为 CYP51B 未能成功沉默，而 CYP51A 和 CYP51B 可能都需要被沉默才能显著降低CYP51酶水平。

AflC/AflD/AflR沉默显著降低感染籽粒中的黄曲霉毒素积累。 LC-MS检测显示，感染黄曲霉时，4个 AflC/AflD/AflR 转基因株系（4、5、6和8号）的AFB1和AFB2水平显著降低；感染寄生曲霉时，2个转基因株系（12和17号）的四种黄曲霉毒素均显著降低，其中12号株系的黄曲霉毒素含量极低。8号株系感染寄生曲霉时AFB2和AFG2显著降低，但AFB1和AFG1无降低。

siRNA的产生。 小RNA测序确认所有转基因植株均产生siRNA，所有五个RNAi触发序列均产生大量siRNA。siRNA主要为21 nt，其次为22 nt和24 nt。在 AflC/AflD/AflR 转基因株系中，未感染样品的siRNA水平显著高于感染样品。

四、讨论与结论

本研究表明，靶向两种曲霉物种中多个黄曲霉毒素生物合成基因的HIGS策略可有效减少成熟玉米籽粒中的黄曲霉毒素污染。转基因玉米未表现出明显的多效性表型，表明RNAi触发序列设计的重要性。同时靶向多个基因的策略降低了单基因功能丧失被补偿的可能性。值得注意的是，12号 AflC/AflD/AflR 株系的黄曲霉毒素总量比非转基因感染对照低200倍，低于美国食品药品监督管理局（FDA）规定的20 ppb行动水平。沉默水平与黄曲霉毒素减少程度呈正相关。 CYP51A/CYP51B RNAi构建体未能有效沉默 CYP51B，真菌生长未受显著抑制，可能因为 CYP51A 的下调被不受影响的 CYP51B 表达所补偿。不同转基因株系间沉默效率的差异可能归因于靶基因天然表达水平、mRNA稳定性、触发序列在基因中的位置以及两种真菌物种RNAi机制效率等因素。黄曲霉中的沉默效果优于寄生曲霉，可能与两物种靶基因基线表达水平差异或siRNA摄取效率差异有关。研究人员观察到未感染植株中转基因来源的siRNA积累显著高于感染植株，可能与靶标存在影响sRNA稳定性有关。尽管 AflC/AflD/AflR 转基因株系显著降低了黄曲霉毒素积累，但植株仍易受曲霉感染，因此需要与靶向真菌增殖必需基因的HIGS相结合，以实现有效防控。HIGS本质上是一种转基因解决方案，许多最需要的非洲国家目前尚不接受转基因作物。研究人员总结认为，HIGS沉默 Afl 基因可在无明显不良表型的情况下显著降低成熟籽粒中的黄曲霉毒素水平，同时沉默黄曲霉毒素生物合成基因和真菌生长必需基因的工程策略可为黄曲霉毒素污染提供有效且可持续的解决方案。未来研究应优化RNAi构建体、考察储存期间HIGS介导的削减效果的持续性、探索抑制真菌生长的新靶基因，并在田间条件下评估转基因玉米的污染情况。