甜椒轻斑驳病毒山东分离物的全序列测定及侵染性克隆构建

　　

摘要：

【目的】甜椒轻斑驳病毒（paprika mild mottle virus，PaMMV）属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），近年来在多个国家的辣椒上相继检出，但目前尚无国内分离物全基因组序列报道。本研究旨在探究PaMMV国内分离物的序列详情、遗传进化，并构建病毒基因组cDNA全长侵染性克隆，为病毒研究和防治提供基础材料和技术支撑。【方法】使用RT-PCR和RACE相结合的方法扩增PaMMV的全基因组序列，使用DNAMAN 8.0、SDTv 1.2和MEGA 6.0软件对序列进行一致性分析和遗传进化分析；利用同源重组方法进行基因组全长cDNA克隆构建，并构建基于侵染性克隆改造的GFP蛋白表达载体；利用农杆菌介导法和摩擦接种法验证PaMMV基因组全长cDNA克隆的系统侵染性。【结果】拼接获得一株PaMMV山东分离物（PaMMV-CN）的基因组全长序列（GenBank登录号：OR365081），全长6 524 nt，基因组由5′末端非编码区（untranslated region，UTR），4个分别编码复制相关蛋白（Rep）、RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）、运动蛋白（MP）、外壳蛋白（CP）的开放阅读框（open reading frame，ORF）以及3′末端非编码区（3′ UTR）组成；序列分析显示，PaMMV-CN与已报道的4个PaMMV分离物核苷酸序列一致性较高，为98.3%—99.6%；系统发育分析显示，PaMMV-CN和其他4个PaMMV分离物形成明显聚类，与同属的多种辣椒常发病毒聚在群体较大的group III；构建的PaMMV全长cDNA克隆（pCB301-PaMMV）可以系统侵染本氏烟，在本氏烟系统叶引起卷叶症状，系统叶提取的病毒粒子在电镜下可以观察到明显的杆状粒子；pCB301-PaMMV能侵染‘茄门’甜椒、‘天宇’朝天椒、‘8819’长线椒和‘好农11’泡椒，在‘茄门’甜椒上症状最为明显，表现斑驳症状和叶面坏死性斑点，在‘天宇’朝天椒、‘8819’长线椒和‘好农11’泡椒上引起不同程度的皱缩、花叶或疱斑症状；构建的携带GFP报告基因的表达载体（pCB301-PaMMV-GFP）能高效、系统侵染本氏烟和‘茄门’甜椒，在本氏烟上引起卷叶症状且在紫外下能观察到明显的绿色荧光，在‘茄门’甜椒上能引起斑驳症状，系统叶在紫外下能观察到绿色荧光。【结论】成功获得了一条PaMMV山东分离物PaMMV-CN全基因组序列，进而构建了侵染性克隆pCB301-PaMMV，能够系统、高效侵染本氏烟和辣椒，且能用于稳定表达外源蛋白GFP。明确了山东省PaMMV的序列详情，可为该病毒后续研究提供有力工具。