基于柑橘叶斑驳病毒的VIGE体系构建与应用

　　

摘要：

【目的】病毒介导的基因编辑（virus-induced genome editing，VIGE）技术在植物中已得到广泛应用，但在柑橘上的研究仍处于起步阶段。本研究旨在建立基于柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）的VIGE体系，以期为柑橘提供一种方便快速的基因编辑工具。【方法】基于病毒表达载体pCLBV202构建靶向烟草PDS的系列含或不含tRNA元件的gRNA递送载体，农杆菌介导注射接种本氏烟（Nicotiana benthamiana）转Cas9株系KQ334，通过表型观察、靶位点扩增及限制性内切酶酶切（PCR/RE）、Hi-TOM高通量测序分析编辑事件，明确tRNA元件的数量及位置对编辑效率的影响；针对四川胜红蓟曲叶病毒（ageratum leaf curl Sichuan virus，ALCScV）基因组不同功能区设计特异性sgRNA并利用所建VIGE体系进行递送，接种ALCScV侵染性克隆并通过qPCR检测病毒积累量，评估其抗病毒效果；以转Cas9锦橙为材料，通过发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）K599介导的真空浸润法导入靶向柑橘PDS的VIGE载体，筛选阳性毛状根并进行基因编辑验证。【结果】pCLBV202-tRNA-NbPDS sgRNA-tRNA处理后4周引起了明显的白化表型，PCR/RE检测到特异性目标片段，测序显示靶标位点处出现了多种类型的碱基突变，包括单碱基插入、单或多碱基缺失，表明本氏烟KQ334发生了基因编辑事件；Hi-TOM高通量测序结果表明，pCLBV202-tRNA-NbPDS sgRNA诱导的突变率为13.54%—20.84%，显著优于不含tRNA元件的处理组（1.10%—2.94%）。ALCScV防控试验中，所有处理组均检测到病毒靶基因编辑事件；qPCR检测结果显示，各处理组的病毒积累量较对照组均有不同程度的下降，其中pCLBV202-tRNA-AL sgRNA1-tRNA在处理后3、5、7 d的病毒积累量较对照组均显著下降(P≤0.05)。利用转Cas9锦橙，通过发根农杆菌介导的真空浸润转化法获得pCLBV202-tRNA-CsPDS sgRNA阳性植株，PCR/RE检测结果初步验证已发生基因编辑。【结论】建立了基于柑橘叶斑驳病毒的VIGE体系，实现对烟草的高效基因编辑，并在柑橘中得到初步验证。该系统不依赖组织培养，具有应用于DNA病毒防控的潜力，并有望用于柑橘新种质创制。