黄花败酱水提物联合FOLFOX化疗方案协同抗结肠癌作用及机制研究

《Integrative Medicine Research》：Beneficial effects of combining Patrinia scabiosaefolia with FOLFOX in colon cancer treatment—preclinical validation

　　

摘要 背景：黄花败酱（Patrinia scabiosaefolia）是结肠癌患者常用处方草药。研究人员前期已证实黄花败酱水提物（PSW）通过调节免疫反应在体内发挥抗肿瘤活性。本研究旨在明确PSW联合FOLFOX（结肠癌一线化疗方案）在结肠癌中的体外及体内疗效。 方法：采用结肠癌细胞研究PSW与FOLFOX联合的细胞毒效应，并利用SynergyFinder软件进行分析。通过集落形成、凋亡、迁移实验及Western blot验证体外联合效应。采用Colon 26荷瘤小鼠评估联合治疗对肿瘤进展及肿瘤微环境变化的影响。利用16S rRNA测序分析治疗后荷瘤小鼠的肠道菌群组成。 结果：PSW与FOLFOX联合在HCT116细胞中表现出协同细胞毒效应，其最佳联合浓度可诱导显著的凋亡效应并抑制迁移。该联合可明显下调TGF-β-smad2/3-N-钙黏蛋白及FAK-RhoA-cofilin通路的蛋白表达。此外，联合治疗在小鼠中可有效抑制肿瘤生长，增加肿瘤内T细胞和巨噬细胞数量。最后，肠道菌群分析显示FOLFOX治疗降低了放线菌门（Actinobacteriota）丰度，而PSW治疗可逆转该变化。 结论：本研究首次阐明PSW与FOLFOX联合可协同发挥抗肿瘤及抗转移作用，支持PSW作为结肠癌患者化疗辅助用药的应用。

论文解读：黄花败酱水提物联合FOLFOX方案治疗结肠癌的增效减毒作用及机制探索

一、研究背景与意义

结肠癌是发生于结肠的胃肠道恶性肿瘤，是全球发病率第三位、死亡率第二位的人类常见恶性肿瘤。多数患者在确诊时已处于疾病中晚期，病理生理特征复杂。目前化疗仍是结肠癌治疗的主要手段，其中FOLFOX方案由氟尿嘧啶（5-FU）、奥沙利铂和亚叶酸钙组成，通过阻断DNA复制抑制肿瘤细胞，是晚期或转移性结肠癌患者的一线化疗方案。FOLFOX虽能提高结直肠癌患者生存率，但其毒副作用严重限制了临床应用。大量研究表明，中药与化疗等现代肿瘤治疗手段联用可显著增强抗肿瘤疗效、降低毒副作用，最终改善患者生活质量和生存期。黄花败酱（Patrinia scabiosaefolia）为败酱科植物，其根及地上部分均可入药，具有清热解毒、消痈排脓、活血化瘀功效，临床广泛用于腹泻、急性肝炎、盆腔炎、溃疡性结肠炎及肿瘤等疾病的治疗。现代药理学研究已证实其具有抗炎、抗菌、抗病毒及抗肿瘤作用。前期研究显示PSW通过阻滞G1/S细胞周期、影响增殖、诱导线粒体依赖性凋亡及抑制肿瘤血管生成发挥抗结肠癌作用。鉴于FOLFOX方案与中药复方联用可提高结肠癌患者肿瘤缓解率和一年生存率并减轻化疗副作用，研究人员推测PS联合FOLFOX治疗结肠癌可能实现增效减毒的效果，因此开展本研究以验证PSW联合FOLFOX治疗结肠癌的体内外疗效并阐明其潜在机制。

二、主要技术方法

本研究采用人结肠癌细胞系HCT116和小鼠结肠癌细胞系Colon 26进行体外实验，通过MTT细胞活力实验评估药物细胞毒作用，利用SynergyFinder软件分析药物联合的协同效应，通过集落形成实验、Transwell迁移实验和流式细胞术分别检测细胞增殖、迁移和凋亡，采用Western blot检测迁移及上皮间质转化（EMT）相关蛋白表达。体内实验采用原位Colon 26荷瘤BALB/c小鼠模型，小鼠由香港中文大学实验动物服务中心提供，经动物实验伦理委员会批准（编号21-287-MIS），通过灌胃给予PSW（1.6 g/kg，每周6天，共25天）和腹腔注射FOLFOX（5-FU 50 mg/kg、亚叶酸钙8.3 mg/kg、奥沙利铂1.75 mg/kg，每周1次，共4次），评估肿瘤生长、肺转移及肿瘤微环境变化，利用流式细胞术检测肿瘤内免疫细胞亚群，通过16S rRNA测序分析粪便样本肠道菌群组成。

三、研究结果

3.1 PSW联合FOLFOX在结肠癌细胞中的协同浓度筛选及细胞毒效应

FOLFOX在HCT116和Colon 26细胞中的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为1.79 ± 0.3 μg/mL和0.625 ± 0.05 μg/mL。PSW与FOLFOX联合在HCT116细胞中较单药更有效抑制细胞生长，PSW和FOLFOX的IC₅₀值均降低超过50%。在Colon 26细胞中，联合治疗使PSW的IC₅₀值从740.91 μg/mL显著降至165.48 μg/mL，降幅达77.7%。SynergyFinder分析显示，HCT116细胞中零相互作用效能（ZIP）协同评分为6.356，表明联合具有协同作用，最佳浓度为400 μg/mL PSW和0.625 μg/mL FOLFOX；而Colon 26细胞中ZIP评分为-2.762，显示拮抗作用，但800 μg/mL PSW与0.625 μg/mL FOLFOX组合在所有测试浓度中细胞毒效应最强。

3.2 PSW与FOLFOX联合对结肠癌细胞集落形成、迁移和凋亡的影响

集落形成实验显示，联合治疗（400 μg/mL PSW和0.625 μg/mL FOLFOX）显著抑制HCT116细胞克隆形成数，抑制效果显著强于PSW或FOLFOX单药治疗。Transwell迁移实验表明，PSW单药显著减少两种结肠癌细胞系转移细胞数，而PSW与FOLFOX联合不仅进一步抑制两种细胞系迁移，且联合效果显著优于单药治疗。流式细胞术检测凋亡显示，HCT116细胞中PSW、FOLFOX及联合组的凋亡率分别为3.22%、3.96%和20.15%，联合治疗的凋亡诱导显著高于单药；而Colon 26细胞中三组凋亡率分别为31.2%、69.8%和39.4%，联合治疗对凋亡的诱导效果不及FOLFOX单药。

3.3 PSW与FOLFOX联合对迁移及EMT相关蛋白表达的影响

与对照组相比，PSW与FOLFOX联合治疗显著抑制迁移相关通路TGF-β-smad2/3（TGF-β R1、smad2/3、smad4）和FAK-RhoA-cofilin通路（FAK、RhoA、ROCK1、Rac123、CDC42、cofilin）相关蛋白表达，而PSW或FOLFOX单药未能显著抑制这些蛋白表达。联合治疗还可显著下调EMT相关蛋白（RhoA、ROCK1、Rac123、N-钙黏蛋白），并显著上调HCT116细胞中E-钙黏蛋白表达，表明联合治疗可协同调控TGF-β-smad2/3、FAK-RhoA-cofilin通路及EMT相关蛋白。

3.4 PSW与FOLFOX联合在Colon 26荷瘤小鼠模型中的联合效应

在治疗期间，对照组和PSW组小鼠体重逐渐增加，而FOLFOX单药组小鼠在治疗后期体重下降并出现食欲减退、活动减少等症状，联合组小鼠未出现明显体重下降。肿瘤生长方面，PSW、FOLFOX及联合治疗均不同程度抑制肿瘤生长，其中联合治疗抑瘤效果最强，最终肿瘤重量为各组最低。免疫组化染色显示，联合治疗减少肿瘤内Ki67和CD31阳性细胞数，而FOLFOX单药未减少CD31阳性细胞，提示联合治疗抑制肿瘤细胞增殖和血管生成。TUNEL染色显示联合组肿瘤内凋亡细胞数最多。肺转移评估显示联合组肺转移面积最小，表明联合治疗对荷瘤小鼠转移具有更强的抑制作用。Western blot检测肿瘤组织转移相关蛋白发现，联合治疗显著降低Smad4、FAK和N-钙黏蛋白表达并上调E-钙黏蛋白表达，与体外数据一致。

3.5 PSW与FOLFOX联合对小鼠肿瘤微环境的影响

流式细胞术检测显示，与对照组相比，联合治疗组肿瘤内辅助性T细胞、细胞毒性T细胞和巨噬细胞数量显著增加，而髓源性抑制细胞（MDSCs）数量的减少在联合组中较PSW或FOLFOX单药组更为明显，表明PSW可能通过调节肿瘤免疫应答增强FOLFOX的抗肿瘤疗效。

3.6 PSW、FOLFOX及其联合对Colon 26荷瘤小鼠肠道菌群的影响

16S rRNA测序结果显示，FOLFOX治疗降低放线菌门（Actinobacteriota）相对丰度，而PSW和联合治疗组较对照组有所增加。α多样性分析显示各组间无显著差异，但Chao1指数在PSW和联合组呈上升趋势、FOLFOX组呈下降趋势。β多样性分析显示对照组与PSW组、FOLFOX组与PSW组、FOLFOX组与联合组间菌群结构存在显著差异。LEfSe分析鉴定出PSW治疗组中Clostridia UCG 014目为显著微生物类群，FOLFOX组中Alistipes属、理研菌科（Rikenellaceae）和颤螺菌科（Oscillospiraceae）为显著差异物种。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，结肠癌远处转移是患者死亡的主要原因，FOLFOX方案虽为常用化疗方案，但存在耐药和严重副作用。本研究首次在HCT116细胞中观察到PSW与FOLFOX联合的显著协同趋势，而Colon 26细胞中表现为相加或拮抗效应，这种差异可能反映物种特异性特征，涉及药物代谢、信号通路和细胞死亡机制等多层面的种间差异。EMT过程在肿瘤侵袭转移中发挥关键作用，E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白是EMT的两个标志性分子，FAK和TGF-β信号通路与肿瘤侵袭转移高度相关。本研究发现PSW与FOLFOX联合可显著抑制TGF-β-smad2/3和FAK-RhoA-cofilin通路并影响EMT过程，在细胞实验和荷瘤小鼠中均得到验证。体内研究进一步证实联合治疗通过调节肿瘤微环境中免疫细胞增强抗肿瘤效果。肠道菌群分析显示FOLFOX降低放线菌门丰度而PSW可逆转该变化，提示肠道菌群调节可能是联合治疗抗结肠癌的潜在机制之一。

研究结论：本研究首次证明黄花败酱水提物与FOLFOX同时应用可通过TGF-β-smad2/3-E-钙黏蛋白和FAK-RhoA-cofilin通路影响上皮间质转化而发挥强效抗肿瘤作用。联合治疗通过调节肿瘤微环境中的免疫细胞进一步增强Colon 26荷瘤小鼠的抗肿瘤效果。此外，研究结果还揭示肠道菌群调节可能是PSW联合FOLFOX抗结肠癌的潜在机制之一。本研究为PSW作为结肠癌化疗（FOLFOX）辅助用药提供了科学证据。