《PLOS One》：Association of IL-6 and IL-10 serum levels with genetic variants in diabetic neuropathy: Clinical findings from a Bangladeshi patient cohort
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背景：糖尿病神经病变（Diabetic Neuropathy, DN）是糖尿病常见的并发症，与慢性炎症密切相关。白介素-6（Interleukin-6, IL-6）和白介素-10（Interleukin-10, IL-10）是参与DN发病机制的关
专业摘要翻译
背景：糖尿病神经病变（Diabetic Neuropathy, DN）是糖尿病常见的并发症，与慢性炎症密切相关。白介素-6（Interleukin-6, IL-6）和白介素-10（Interleukin-10, IL-10）是参与DN发病机制的关键细胞因子。本研究旨在探讨孟加拉人群中IL6和IL10基因多态性及其血清水平与DN的关联。
材料与方法：开展了一项病例对照研究，共纳入225名参与者：伴有DN的糖尿病患者（n=75）、不伴DN的糖尿病患者（n=75）和健康对照者（n=75）。提取基因组DNA，通过PCR对IL-6（rs1800796）和IL-10（rs1800896）单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）进行基因分型。采用酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测血清细胞因子水平。
结果：DN组的血清IL-6水平显著高于其他研究组（p<0.0001），其中携带IL-6 rs1800796 CC基因型的个体水平最高。在未调整分析中，与健康对照相比，IL-6 CC基因型与DN风险增加相关（OR=4.813，95% CI：1.752–13.85，p=0.0040），IL-10 GG基因型同样如此（OR=2.679，95% CI：1.000–6.751，p=0.0373）。然而，经过多变量调整后，IL-6和IL-10基因型均未保持与DN的独立关联。各研究组间血清IL-10水平无显著差异（p=0.0948）。联合基因型分析显示若干名义上的关联，但这些发现属于探索性结果。血清IL-6在区分DN患者与其他研究组方面显示出有前景的判别能力，而IL-10的判别性能有限。
结论：这些发现支持进一步研究血清IL-6作为糖尿病神经病变的潜在候选生物标志物，而所研究的IL-6和IL-10多态性的独立贡献仍不确定。在考虑临床应用之前，需要更大规模的前瞻性研究并进行独立外部验证。
论文解读文章
一、研究背景与意义
糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是一种以持续性高血糖为特征的慢性代谢性疾病，其患病率在孟加拉国因城市化、生活方式改变和膳食结构转型而迅速上升。2020年孟加拉国约有1310万成年人患有糖尿病，预计到2045年这一数字将大幅增加。糖尿病神经病变（Diabetic Neuropathy, DN）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，显著导致疼痛、残疾、足部溃疡、住院以及非创伤性下肢截肢。DN由长期高血糖引起，导致全身神经损伤，症状包括从轻微刺痛到严重烧灼感或射击样疼痛等多种不适。尽管DN危害严重，但其确切机制仍不清楚。病理改变涉及氧化应激、多元醇通路激活、晚期糖基化终产物积累及蛋白激酶C激活等，这些过程均会破坏神经功能。高血糖与临床DN之间的精确关系尚不确定，现有假说认为慢性高血糖及相关危险因素可能通过活性氧和线粒体功能障碍导致微血管内皮损伤和神经元损伤。此外，无痛性与疼痛性DN在机制和病理学上的区别尚未阐明。
在DN发病机制的关键贡献因素中，炎症过程尤为重要，其中IL-6和IL-10等细胞因子发挥核心作用。IL-6是促炎细胞因子，IL-10是抗炎介质，两者在调节免疫反应和维持炎症平衡中均发挥关键作用。这些细胞因子表达的失调与慢性炎症的发展有关，而慢性炎症是DN的标志性特征。编码IL-6和IL-10的基因变异（多态性）可能导致细胞因子表达改变，从而影响糖尿病患者对神经病变的易感性和严重程度。IL-6基因启动子区域的rs1800796 SNP（?572 G/C）影响IL-6表达；IL-10基因rs1800896多态性（?1082 G/A）可影响IL10基因的转录活性，导致IL-10产生水平差异。开展这项研究的目的是探讨孟加拉人群中特定IL6和IL10基因多态性及其血清水平与DN的关联，通过分子谱分析和遗传分析识别可能使个体易患此并发症的遗传标志物，为理解DN的炎症机制提供基础。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员开展了一项病例对照研究，从达卡医学院医院和坚德布尔糖尿病医院收集临床数据和血液样本，共纳入225名参与者，分为三组：伴有DN的2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM）患者（n=75）、不伴DN的T2DM患者（n=75）和健康非糖尿病对照者（n=75）。参与者年龄25–70岁，排除了孕妇及维生素B12缺乏、甲状腺功能减退、慢性酒精使用、化疗史、慢性肾病或其他已知神经系统疾病等可能引起周围神经病变的个体。DN诊断通过临床检查和验证的筛查工具（包括10g单丝压力觉测试、128Hz音叉振动觉和针刺感觉评估）以及密歇根神经病变筛查工具（Michigan Neuropathy Screening Instrument, MNSI）确认，MNSI评分≥2.5提示神经病变。研究主要采用以下关键技术方法：使用TIANgen血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop?紫外-可见分光光度法评估DNA质量和数量；采用四引物扩增 refractory 突变系统PCR（Tetra-Primer ARMS-PCR）对IL-6 rs1800796进行基因分型，采用扩增 refractory 突变系统PCR（ARMS-PCR）对IL-10 rs1800896进行基因分型；PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，纯化后提交至韩国Macrogen公司进行Sanger测序验证；使用FineTest（中国）商业ELISA试剂盒定量血清IL-6和IL-10浓度；统计分析采用GraphPad Prism 8.0软件，包括单因素方差分析（ANOVA）、Tukey多重比较检验、Pearson卡方检验、Fisher精确检验、多变量二元逻辑回归分析和受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线分析。
三、研究结果
参与者社会人口学、人体测量学和生化特征：伴有DN的T2DM组平均年龄（62.64±0.8455岁）显著高于不伴DN的T2DM组（54.07±0.9809岁）和健康对照组（48.55±1.226岁）（p<0.0001）。城市居住比例在DN组更高（77.33%）。DN组的体重和BMI显著更高（70.19±1.14 kg，25.19±0.32 kg/m2）。DN组的收缩压和舒张压均显著升高。生化方面，DN组的空腹血糖、随机血糖和HbA1c水平显著更高，血脂谱显示总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白升高而高密度脂蛋白降低，肾功能标志物（血尿素氮和肌酐）、炎症标志物C反应蛋白以及肝酶AST和ALT也显著升高。
IL-6和IL-10多态性的基因型分析：通过T-ARMS-PCR对IL-6 rs1800796进行基因分型，G等位基因产生237 bp和125 bp条带，C等位基因产生237 bp和157 bp条带。通过ARMS-PCR对IL-10 rs1800896进行基因分型，A等位基因产生259 bp片段，G等位基因产生258 bp片段。Sanger测序确认扩增片段对应IL6基因，在?572位置存在C等位基因。由于测序技术限制，IL-10 rs1800896核苷酸位置未能直接确认。
IL-6 rs1800796和IL-10 rs1800896的基因型和等位基因分布：IL-6 rs1800796的GC基因型在DN组（41.33%）和不伴DN组（53.33%）中最常见，而GG基因型在健康对照组中最常见（50.67%）。G等位基因频率从健康对照（71.33%）下降到不伴DN组（54.67%）和DN组（54.00%），C等位基因频率从对照组的28.67%增加到DN组的46.00%。IL-10 rs1800896的AG基因型在DN组（48.00%）和健康对照组（48.00%）中最常见，AA基因型在不伴DN组中更常见（41.33%）。G等位基因频率从对照组的38.67%增加到DN组的50.67%。两个多态性在健康对照组的基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE）。
IL-6 rs1800796和IL-10 rs1800896基因型分布与DN风险的关联：IL-6 rs1800796 CC基因型在DN患者中显著更常见（25.33% vs 8.00%；OR=4.813，95% CI：1.752–13.85；p=0.0040）。C等位基因与DN风险增加相关（OR=2.120，95% CI：1.330–3.458；p=0.0028），C等位基因携带也与DN风险增加相关（OR=2.054，95% CI：1.056–3.902；p=0.0467）。G等位基因携带与DN风险降低相关（OR=0.256，95% CI：0.114–0.613；p=0.0361）。IL-10 rs1800896 GG基因型与DN风险增加相关（OR=2.679，95% CI：1.000–6.751；p=0.0373）。但DN组与不伴DN组之间未观察到显著的等位基因或携带水平差异。
IL-6和IL-10多态性对DN风险的联合效应分析：以（GG，AG）组合为参考，携带CC（IL-6）和AA（IL-10）基因型的个体DN风险显著增加（OR=8.00，95% CI：1.40–45.76，p=0.0234），GC/GG组合也与风险增加显著相关（OR=5.33，95% CI：1.13–25.12，p=0.0367）。其他组合未显示统计学显著关联。由于部分联合基因型类别参与者数量较少，这些结果应视为探索性估计。
多变量逻辑回归分析：以DN为因变量，调整年龄、BMI、HbA1c、收缩压、HDL胆固醇、LDL胆固醇、甘油三酯以及IL-6和IL-10基因型后，HbA1c是唯一与DN显著独立相关的因素（AOR=2.91，95% CI：1.80–4.71，p<0.001）。HbA1c每增加1%，DN风险增加约2.9倍。IL-6和IL-10基因型在调整后不再与DN独立相关。
各组血清IL-6和IL-10水平：DN组血清IL-6水平（37.24±1.19 pg/mL）显著高于不伴DN组（19.33±0.59 pg/mL）和健康对照组（14.58±0.60 pg/mL）（p<0.0001）。携带IL-6 rs1800796 CC基因型的个体IL-6水平最高（41.93±2.21 pg/mL）。血清IL-10水平在各组间无显著差异（ANOVA p=0.0948），IL-10 rs1800896基因型与IL-10水平无显著关联。
血清IL-6和IL-10水平与临床参数的相关性分析：在DN组中，血清IL-6水平与糖尿病病程（r=0.4315，p=0.0061）和神经病变病程（r=0.3952，p=0.0128）呈显著正相关。IL-10水平在所有研究组中均未与临床参数显示显著相关性。
IL-6和IL-10作为潜在生物标志物的分析：血清IL-6区分DN患者与健康对照的AUC为0.9034（95% CI：0.8280–0.9787；p<0.0001），在27.26 pg/mL的探索性截断值下，敏感度为71.79%，特异度为100%。区分DN患者与不伴DN的糖尿病患者的AUC为0.8547（95% CI：0.7662–0.9432；p<0.0001），截断值30.74 pg/mL时敏感度69.23%，特异度100%。血清IL-10在所有组间比较中AUC均低于0.60，判别性能有限。
四、讨论与结论
讨论部分指出，DN患者表现出与不伴DN的糖尿病患者和健康对照不同的社会人口学、人体测量学和生化特征，证实了DN的多因素性质。多变量回归分析显示HbA1c是DN的唯一独立预测因素，强调血糖控制不佳对疾病发展的主导贡献。IL-6 rs1800796的CC基因型、C等位基因和C(+)携带在DN患者中更常见并与疾病风险增加相关，但这些关联主要在与健康对照的比较中观察到，在DN患者与不伴DN的糖尿病患者之间未达到统计学显著，提示这些遗传关联可能反映对糖尿病相关炎症过程的易感性而非特异性针对神经病变。IL-10 rs1800896的关联一致性较差，且未伴随循环IL-10浓度的相应差异。联合基因型分析发现若干名义显著关联，但因低频组合导致置信区间宽泛，不支持明确的基因-基因协同相互作用。DN患者循环IL-6浓度持续升高，携带CC基因型者IL-6水平最高，支持该多态性可能通过调节炎症活性而非作为独立临床预测因子参与DN。IL-6水平与糖尿病和神经病变病程正相关，支持其在慢性炎症和疾病进展中的作用。ROC分析显示IL-6具有有前景的判别能力，但截断值源于同一小规模横断面队列且未经外部验证，应视为探索性结果。研究局限性包括样本量相对有限、未进行多重比较校正、单中心研究且缺乏独立复制队列。
结论部分指出，本研究确定了DN患者血清IL-6水平升高和IL-6 rs1800796变异。探索性ROC发现提示血清IL-6可能是区分DN患者与不伴DN的糖尿病患者及健康个体的潜在候选标志物。然而，这些发现来自相对较小的横断面队列，提出的截断值未经外部验证，因此尚不能确定IL-6的临床诊断效用。在考虑将血清IL-6用于诊断或风险分层应用之前，需要更大规模的前瞻性多中心研究和独立验证队列。相比之下，IL-10相关发现大多不显著且不一致，血清IL-10水平在各组间无显著差异，与所研究的基因型或临床变量无关，判别性能有限。本研究未确立IL-10作为DN标志物或决定因素的明确作用。未来研究应聚焦于在多样化人群中开展更大规模的纵向多中心研究，整合先进的基因组和蛋白质组学技术，探索细胞因子水平、遗传因素与DN进展之间的时间关系，并研究将细胞因子谱、遗传信息和临床危险因素与预测建模方法（包括机器学习）相结合能否改善DN风险患者的识别。
