表达间日疟原虫红前期抗原SSP3与SPECT1的转基因伯氏疟原虫：解析其疫苗开发潜力

《PLOS Pathogens》：Transgenic Plasmodium berghei expressing P. vivax pre-erythrocytic antigens SSP3 and SPECT1 to elucidate their efficacy towards vaccine development

　　

摘要专业翻译 开发针对间日疟原虫（Plasmodium vivax）疟疾的高效疫苗仍是全球卫生的首要优先事项。间日疟原虫可形成休眠体（hypnozoites），即寄生虫在肝脏中的休眠形态，可在数月甚至数年后被重新激活，导致疟疾复发并增强传播。因此，靶向红前期（pre-erythrocytic，PE）阶段表达的抗原，有望预防初次感染和复发感染所致的临床疟疾。环子孢子蛋白（circumsporozoite protein，CSP）是领先的红前期疫苗候选抗原，也是当前恶性疟原虫（P. falciparum）疟疾疫苗RTS,S和R21/Matrix-M的基础。研究表明，在间日疟原虫中，CSP提供的保护有限，凸显了识别额外红前期抗原以提高疫苗效力的必要性。新候选疫苗的评估往往需要人类志愿者，这使得初步筛选复杂化，并凸显了对稳健临床前模型的需求。在本研究中，研究人员生成了转基因伯氏疟原虫（P. berghei）虫株，作为研究工具来评估两种间日疟原虫红前期疫苗候选抗原SSP3和SPECT1的潜在效力。嵌合体Pb-PvSSP3和Pb-PvSPECT1虫株在小鼠和蚊虫中的整个寄生虫生命周期均表现出正常发育。使用TitreMax Gold佐剂针对重组PvSSP3和PvSPECT1产生的抗血清，在体外（in vitro）表现出对子孢子（sporozoite）入侵肝细胞的抑制作用，平均抑制率分别为27%和14%。体内（in vivo）子孢子攻击研究表明，以重组PvSPECT1免疫的小鼠中10%获得无菌保护（sterile protection），而重组PvSSP3未提供可检测的保护。尽管在所测试条件下两种抗原均未观察到显著保护，但本研究生成的转基因伯氏疟原虫虫株可作为评估这些抗原在不同递送系统和佐剂配方中作为疫苗候选抗原效力的有用平台。

论文解读

一、研究背景与意义

疟疾由顶复门（apicomplexan）寄生虫——疟原虫属（Plasmodium）引起，2024年全球报告病例达2.82亿例，死亡61万例。间日疟原虫引起的疟疾虽不如恶性疟原虫严重，但有时可致死，且广泛分布于撒哈拉以南非洲以外的地区，尤其在东南亚、拉丁美洲和西太平洋部分地区。间日疟原虫的一个独特挑战在于其能形成休眠体——肝脏中处于休眠状态的寄生虫形态，可在感染蚊虫叮咬数月甚至数年后被激活，导致新的血液期感染（即复发）。此外，间日疟原虫的配子体（gametocytes）在初次血液期感染时即出现，可在临床症状发展前就促进传播，妨碍了群体水平的疟疾控制。耐药株的潜在扩散进一步构成了消除疟疾的主要障碍，凸显了疫苗开发的重要性。

红前期（PE）疟疾疫苗的开发有望实现无菌保护性免疫。PE阶段涵盖从雌性按蚊将活动子孢子沉积于真皮，到第一代裂殖子释放入血的临床沉默过程。靶向此阶段至关重要，可预防临床疾病；对间日疟原虫而言，有效的PE疫苗可预防休眠体形成及后续复发。目前有两种获批的疟疾疫苗——RTS,S（Mosquirix）和R21/Matrix-M，均靶向恶性疟原虫CSP，但无法对间日疟原虫或其他疟原虫物种提供交叉保护。间日疟原虫CSP具有三种等位变异型，且唯一经临床测试的基于CSP的间日疟原虫PE疫苗虽安全，但在人体试验中未能提供保护。其他已探索的候选抗原如TRAP和CelTOS，仅提供部分或较弱的保护效果。因此，亟需识别互补的PE抗原，纳入更稳健的多阶段、多价疫苗配方中。

SSP3（sporozoite surface protein 3，子孢子表面蛋白3）和SPECT1（sporozoite microneme protein essential for cell traversal，子孢子微线体细胞穿越必需蛋白1）被选为候选抗原，二者在接触哺乳动物样环境时表达上调。SSP3是定位于子孢子表面的I型跨膜蛋白，在滑动运动和红外期（exoerythrocytic forms，EEFs）成熟中发挥关键作用；SPECT1是微线体来源蛋白，对寄生虫穿越宿主细胞（如Küpffer细胞和肝血窦壁）至关重要。两种抗原在自然感染后均表现出高血清阳性率，并能诱导功能性抑制抗体。然而，间日疟原虫缺乏稳健的连续体外血液期培养系统，子孢子的获取仅限于人或灵长类感染，这成为评估PE疫苗候选抗原效力的瓶颈。转基因伯氏疟原虫（啮齿动物疟疾）模型可作为评估PE疫苗候选抗原体内外效力的替代平台。

二、研究内容概述

研究人员采用两步GIMO（gene insertion/marker out，基因插入/标记清除）转染技术，将伯氏疟原虫内源性ssp3和spect1基因分别替换为间日疟原虫同源基因，生成了表达PvSSP3（PVP01_1427900）和PvSPECT1（PVP01_1212300）的转基因虫株Pb-PvSSP3（3395cl1）和Pb-PvSPECT1（3378cl1）。随后系统评估了转基因虫株在小鼠和蚊虫中的完整生命周期适应性，包括无性血液期增殖、蚊虫传播能力（卵囊和唾液腺子孢子数量）、子孢子感染性（体外肝期发育、体内肝负荷、潜伏期），并通过体外肝期发育抑制试验（inhibition of liver stage development assay，ILSDA）和体内子孢子攻击实验评估了疫苗保护效力。免疫血清来自此前研究中使用重组PvSSP3和PvSPECT1（以TitreMax Gold为佐剂）免疫BALB/c小鼠所产生的抗血清。

三、主要研究结果

抗原选择与转基因虫株的生成

研究人员基于SSP3和SPECT1在活化子孢子中表达上调及其在PE感染级联中的推定作用而选择这两种抗原。PvSSP3与伯氏疟原虫SSP3具有48%的同一性和64%的同源性；PvSPECT1与伯氏疟原虫SPECT1具有43%的同一性和69%的同源性。通过两步GIMO转染技术，成功生成了无药物选择标记的嵌合体Pb-PvSSP3和Pb-PvSPECT1转基因虫株，并通过诊断性PCR和脉冲场凝胶电泳分离染色体的Southern印迹杂交分析确认了靶向构建体的正确整合。

转基因虫株在小鼠和蚊虫中表现出类野生型生长

在克隆过程中测定的无性血液期增殖率显示，Pb-PvSSP3和Pb-PvSPECT1克隆在注射单一致病寄生虫后第8天的寄生虫血症为0.5%–2%，与野生型伯氏疟原虫ANKA相当。蚊虫传播实验中，两种转基因虫株产生的蚊虫中肠卵囊数量和唾液腺子孢子数量均与野生型无显著差异（p>0.99和p=0.98/0.99）。免疫荧光分析确认了PvSSP3和PvSPECT1蛋白在转基因子孢子表面的表达，而免疫前血清无免疫反应性。

转基因虫株表现出正常的肝期发育

在HC-04人肝癌细胞系中，Pb-PvSSP3和Pb-PvSPECT1转基因EEFs在12、24、36、48和60小时感染后各时间点的生长与野生型视觉上相当。48小时时EEF数量和大小均与野生型无显著差异（数量p=0.88/0.99，大小p=0.89/0.97）。静脉注射1×10?子孢子后44小时测定的肝负荷（RLU）与野生型相当（p=0.68/0.99），潜伏期中位数均为第5天，无显著差异（p=0.94）。

SSP3和SPECT1抗血清可阻断转基因子孢子的肝细胞入侵

体外ILSDA结果显示，PvSSP3抗血清的抑制活性范围为16%–43%，平均抑制率为27%（SD=9.8%）；PvSPECT1抗血清的抑制活性范围为8%–27%，平均抑制率为14%（SD=7.5%）。两种免疫血清与TitreMax Gold佐剂对照（p=0.0010和p=0.0101）及无抗体对照（p=0.0003和p=0.0101）相比均显著降低了子孢子对肝细胞的感染。

PvSPECT1在子孢子攻击后为10%小鼠提供无菌保护

体内攻击实验中，所有免疫小鼠均产生了高滴度抗原特异性IgG抗体（rPvSSP3终点滴度24,300–72,900；rPvSPECT1终点滴度72,900–218,700）。rPvSSP3免疫组10只小鼠中7只第6天、3只第7天出现寄生虫血症，与佐剂对照组和 na?ve 组无显著差异（p=0.90），未提供可检测保护。rPvSPECT1免疫组10只小鼠中7只第6天、2只第7天出现寄生虫血症，1只小鼠至第14天仍无寄生虫血症，表明10%无菌保护；但三组间潜伏期无显著差异（p=0.23）。

四、讨论与结论

讨论部分指出，PvSSP3和PvSPECT1成功互补了其伯氏疟原虫同源基因的功能，维持了寄生虫在小鼠和蚊虫中的生物学适应性，这与以往某些恶性疟原虫PE抗原（如P36、P52、B9和SPECT2）无法功能互补的情况形成对比。体外抑制活性与体内保护效果之间的差异表明，部分抑制肝细胞入侵并不必然转化为子孢子攻击后的无菌免疫。rPvSSP3缺乏保护可能归因于表位特异性问题——所选区域（氨基酸19–203，含P48/45结构域）诱导的抗体可能无法识别生理环境下天然蛋白上的保护性表位，使用全长重组蛋白可能改善保护效力。此外，静脉注射攻击途径绕过了皮肤阶段，而抗体可在皮肤阶段限制子孢子运动从而限制其进入血管；近期R21/Matrix-M研究也表明抗体介导的保护对攻击途径敏感。TitreMax Gold作为实验性佐剂可能无法完全反映临床可转化的疫苗平台。未来研究应探索不同的抗原递送平台、临床相关佐剂、多价抗原组合以及蚊虫叮咬或皮内注射等替代攻击途径。

结论部分总结：本研究确立了PvSSP3和PvSPECT1能功能互补其啮齿动物同源基因并可在转基因伯氏疟原虫系统中成功表达。这些转基因寄生虫无标记且可进行进一步遗传操作，为将更多伯氏疟原虫蛋白替换为其间日疟原虫同源基因并评估多价红前期疫苗设计提供了平台。未来研究将探索不同抗原递送平台和临床相关佐剂配方，以增强这些抗原的免疫原性和保护效力，从而支持消除间日疟原虫疟疾策略的开发。