近红外荧光寿命成像：荧光染料、方法与应用

《Journal of Biomedical Optics》：Near-infrared fluorescence lifetime imaging: fluorophores, methods, and applications

　　

荧光发射与福斯特共振能量转移（FRET）激发态通路的示意图。1. 引言荧光寿命 ??，即荧光团在失活前处于激发态的平均时间，反映了图1 Jablonski图中所示的辐射与非辐射衰变通路的综合效应以及福斯特共振能量转移（FRET）能量转移方案。与荧光强度不同——后者受探针浓度、激发功率和组织光学性质的强烈影响——荧光寿命是荧光团在特定微环境中的固有性质。根据荧光团及其底层光物理机制的不同，荧光寿命可受溶剂极性、结合状态、聚集、pH值、猝灭、温度或氧化的调节。这些依赖性使荧光寿命能够报告局部分子环境，而不仅仅是作为信号变异性来源。荧光寿命成像（FLI）在空间上绘制荧光衰减，提供与荧光团身份、分子状态及周围生化或生物物理环境相关的对比度。图1下载全尺寸图像荧光发射与福斯特共振能量转移（FRET）激发态通路的示意图。近红外（NIR）区域（650至950 nm）提供了由组织吸收、散射、自发荧光（AF）、荧光团亮度和探测器灵敏度随波长的贡献所定义的一个生物光学窗口。在此范围内，血红蛋白吸收和组织自发荧光相对于大部分可见光谱通常有所降低，同时散射随波长增加而减小。然而，超出这一传统NIR窗口后，水的吸收以及荧光团亮度和探测器灵敏度的限制变得越来越重要。这种波长依赖性的平衡改善了光子穿透，支持跨完整器官和小动物的荧光成像。将寿命分辨对比度与NIR波长的光学优势相结合，扩展了FLI在生物医学研究中的适用范围。在细胞和组织的微观尺度上，NIR FLI可以分辨荧光团身份、分子状态、微环境和分子相互作用。在宏观尺度上，NIR FLI将这些寿命分辨测量从基于细胞的实验扩展到完整器官和活体动物，将机制性细胞与分子研究与非侵入性临床前分子成像和新兴临床应用程序（包括分子诊断和图像引导干预）连接起来。实现这一潜力需要荧光团在相关生物和测量条件下具有经过严格表征的寿命行为。对于处于固定分子状态的荧光团，探针浓度或激发功率的变化主要按比例缩放检测到的光子计数，而不改变归一化的荧光衰减，前提条件是聚集、自猝灭、重吸收、饱和、光漂白和堆积可以忽略不计。然而，在组织中，深度依赖的光子迁移和时域重叠的背景荧光可能扭曲测量到的衰减，而探测器的时间响应和时间采样限制了短衰减分量的恢复。这些效应对亚纳秒NIR荧光团尤其严重，必须将其与真正的依赖环境变化的荧光寿命区分开来。精确的荧光团表征对于定量NIR FLI的成功实施和持续进步至关重要。所报告的寿命在不同溶剂环境、结合和聚集状态以及温度之间可能存在很大差异。激发和检测波长、探测器响应、采集参数和寿命分析方法的差异进一步使跨研究解释变得复杂。这些因素可能使人们无法分辨所观察到的差异究竟源于荧光团行为、生物环境还是测量过程本身。因此，荧光团的选择必须在光物理性能、生物相容性、仪器限制和应用特定的寿命行为之间取得平衡，并应辅以透明标注的参考数据。这在临床转化的背景下尤为重要，因为可重复性和可再现性至关重要。用于NIR FLI的荧光团设计和选择面临独特的挑战。随着荧光团发射从可见区域向NIR移动，较小的电子能隙促进了非辐射弛豫，导致许多NIR荧光团表现出相对较低的量子产率和较短的荧光寿命。内源性荧光团通常表现出微弱的NIR发射和重叠的光谱特征，同时其荧光寿命受结合状态和代谢背景的强烈调节。这种敏感性支持代谢FLI方法，但在需要靶标特异性对比度的应用中可能限制分子特异性和绝对定量。有机NIR染料（包括氰基、BODIPY和氧杂蒽衍生物）表现出对极性、粘度和聚集高度敏感的寿命。利用胆绿素结合发色团的工程化荧光蛋白（如miRFPs和iRFPs）提供基因编码的NIR荧光，但通常表现出中等量子产率和依赖环境的寿命行为。最后，无机发光体（如量子点或镧系掺杂纳米晶体）提供更长的荧光寿命，但引发了细胞毒性和生物相容性方面的担忧。NIR FLI通过分辨分子状态、相互作用和环境将分子成像扩展到荧光团定位之外。NIR FLI-FRET通过供体寿命猝灭报告分子邻近性，而基于寿命的多重标记分离了具有重叠发射光谱但不同荧光衰减动力学的探针。显微NIR FLI-FRET提供了对探针行为和寿命分量的可控验证，支持在完整动物中进行定量宏观FLI-FRET测量。与微环境感知一起，这些方法将基础机制研究与临床前分子成像联系起来。尽管NIR FLI已在多重标记、FRET、环境感知、临床前小动物成像和早期临床组织表征中得到证明，但更广泛的临床转化仍然有限。大多数荧光引导手术（FGS）系统仍然主要依赖荧光强度而非寿命分辨对比度。因此，本综述优先关注荧光寿命被直接测量的应用，并在其提供相关临床或转化背景时讨论仅强度研究。聚焦于与跨细胞、组织和活体受体的定量NIR FLI相关的荧光团，本综述批判性地评估了外源性有机染料、荧光蛋白、无机发光体和内源性荧光团的光物理性质和所报告的寿命。特别强调测量条件、仪器和分析方法如何影响寿命值及其在寿命分辨应用中的解释。本综述考察NIR光物理学和荧光团类别，随后介绍在多重标记、基于FRET的分子相互作用成像、微环境感知和临床转化中的应用。后续章节评估采集模式、探测器架构、计算分析方法、可重复定量的障碍以及标准化路径。通过将荧光团设计、光物理性质和所报告寿命特征与成像仪器、分析和应用特定证据相结合，本综述定义了定量NIR FLI成功实施和持续进步的关键要求。表1–5中总结的荧光寿命值汇编自不同溶剂环境、结合状态、温度和仪器及分析方法下获得的数据。优先考虑同行评审来源，仅在制造商数据表或预印本直接支持所报告的光物理或寿命值时包含在内。因此，这些值应被解释为代表性的报告范围而非可直接比较的测量值，这进一步强调了NIR荧光寿命研究中标准化报告的需要。2. NIR特异性光物理学NIR荧光团呈现独特的光物理挑战。特别是，波长更长的光子必然具有更低的能量，如Planck关系所述：方程(1)??=???/??，其中??是能量，?是Planck常数，??是光速，??是波长。随着??增加，能隙减小，导致在NIR窗口发光的分子具有较小的最高占据分子轨道（HOMO）与最低未占据分子轨道（LUMO）之间的能隙。荧光寿命（??）由辐射与非辐射衰变过程之间的竞争所决定，可表示为方程(2)??=1/(????+??????)，其中????和??????分别是辐射衰变（光子发射）和非辐射衰变的速率常数。量子产率（Φ）类似地定义为方程(3)Φ=????/(????+??????)。对于NIR荧光团，较窄的HOMO–LUMO能隙导致电子态与振动态之间增强的耦合，从而使??????升高。这为NIR荧光团中常见的降低的量子产率和短荧光寿命提供了基本的光物理学基础。因此，已采用多种分子设计策略来实现NIR发射同时最小化??????，包括引入供体–受体结构以及刚化荧光团骨架。有趣的是，尽管较高的??????在亮度方面不利，但它也使许多NIR荧光团对局部环境高度敏感，使它们作为生物传感器具有特别高的价值。这在荧光寿命成像（FLI）的背景下尤其相关，因为荧光寿命测量直接对??????的变化敏感，同时基本独立于荧光团浓度和激发强度。例如，某些NIR荧光团的荧光寿命对溶剂极性敏感，因为极性溶剂可以在激发态荧光团周围重新取向，稳定电荷分离构型，并通过溶剂弛豫增加??????。同样，荧光团与局部蛋白质的相互作用、粘度变化和pH值变化也可能显著影响激发态稳定性。这些染料与环境之间的相互作用通常限制分子内运动，抑制非辐射路径，从而增加荧光寿命。聚集可导致荧光猝灭（聚集导致猝灭，ACQ）或荧光增强（聚集诱导发射，AIE），取决于分子结构，从而带来广泛的传感和成像应用。最后，pH依赖的染料质子化可以改变其电子结构和激发态稳定性，从而实现pH敏感生物传感器的发展。最近的荧光团开发越来越依赖对已建立发色团骨架的合理结构修饰来调节光物理和生物特性。通过工程化共轭骨架和末端基团，发射波长、荧光寿命和量子产率等关键参数可以被系统控制。在NIR区域通过发色团骨架的结构修饰（特别是刚化和平面化）实现了更长的荧光寿命，这些修饰限制分子内旋转和扭曲张弛，抑制内转换，从而减少??????。探针适用性取决于寿命对比度的预期用途。对于探针识别和多重标记，优先要求是在预期标记和生物条件下荧光衰减特征之间可重复地分离。对于环境感知，优先要求是对感兴趣变量的可重复响应，同时来自其他变量的干扰有限。因此，环境敏感性可以支持感知，但同时使探针识别变得复杂。以下章节根据这些不同需求评估荧光团。3. 主要NIR荧光团类别及其寿命特性3.1. 外源性荧光团：有机荧光团有机小分子荧光团构成了NIR FLI的主要基础，因为其可调的分子结构、相对较高的量子产率、表征良好的光物理行为以及与生物偶联或药物修饰的相容性。它们的结构可以被工程化以调节激发和发射波长、亮度、溶解度、靶向性质和荧光寿命。因此，有机NIR荧光团是分子相互作用成像、靶标结合研究、微环境感知以及临床前或临床荧光引导成像中最成熟和广泛使用的发光体类别之一。然而，许多传统NIR染料表现出相对较短的寿命（通常<1 ns）、易受聚集诱导猝灭影响以及对环境的敏感性，这些复杂化了在复杂生物环境中的定量寿命测量。这些局限性推动了结构刚化、化学稳定和功能可调的染料平台的开发，以支持更长且对环境更响应的寿命。有机荧光团的荧光寿命行为与发色团骨架密切相关，后者决定分子刚性、共轭程度和非辐射弛豫路径。代表性的有机NIR发色团框架包括多甲川菁染料（如Cy5–Cy7和IR-1061）、氮杂BODIPY、基于BBTD的结构、酞菁和氧杂蒽衍生物，如图2所示。图2下载全尺寸图像具有不同发色团结构的NIR染料代表结构。BBTD（红色）、菁染料（蓝色）、氧杂蒽（绿色）、氮杂BODIPY（黑色）和金属酞菁（紫红色）。菁染料是最广泛使用的外源性NIR荧光团类别，由两个含氮杂环通过多甲川桥连接组成，形成高度共轭的π电子系统。增加多甲川链长不仅增强了π离域并将吸收红移至NIR区域，还增加了结构柔韧性，通过分子内旋转和振动促进非辐射衰变。因此，菁染料通常表现出亚纳秒至约1 ns范围的短荧光寿命，这是由于沿多甲川链的高效内转换和光异构化。多甲川链上的电荷离域减小了键长交替并促进了快速的激发态失活，而光异构化进一步贡献了能量耗散和寿命缩短。常见的菁衍生物（如Cy5、Cy5.5和Cy7）仍然是具有强摩尔吸光系数（??≈2–3×10? M?1cm?1）的典型NIR发光体。结构优化采用了互补方法：磺酸化改善水溶性并限制聚集，而构象约束、刚化多甲川桥和双菁结构在不进一步延长共轭长度的情况下限制分子内运动和光异构化。这些修饰可以改善光稳定性、量子产率和荧光寿命特性，支持在重叠光谱区域内的多重FLI。菁染料的荧光寿命还强烈取决于其微环境。例如，蛋白质结合（如ICG所观察到的）或微环境粘度增加可以限制多甲川旋转并延长荧光寿命，而水环境中的聚集通常增强非辐射猝灭并降低荧光寿命。酞菁是高度共轭的宏环荧光团，由四个异吲哚单元通过氮原子连接组成，形成平面π离域系统。

这种结构刚性抑制了振动弛豫，与柔性荧光团相比，能够支持相对稳定的激发态。它们的光物理性质强烈依赖于配位的中心金属离子。163 特别是，含有Zn2+、Al3+和Ga3+等抗磁性金属的金属酞菁表现出较高的三重态量子产率和较长的三重态寿命，而Cu2+和Fe2+等顺磁性金属则导致激发态寿命缩短和光化学活性降低。163,164 此外，由于强烈的分子间π–π相互作用，酞菁在水性环境中容易形成聚集体，这降低了荧光量子产率并影响其光物理行为。164 因此，化学修饰（包括磺化和使用纳米载体）通常被用来改善溶解度并减少聚集效应。165

罗丹明染料源自氧杂蒽骨架，这是一种三环π共轭结构，由两个芳香环通过一个中心杂原子（通常是氧）桥接而成，并用给电子的二烷基氨基团进行功能化，从而实现强荧光。166–168 罗丹明类似物的实例如图2所示。然而，大多数经典罗丹明衍生物的吸收和发射位于可见光谱范围内，因此本质上不是近红外（NIR）荧光团。169 通过修饰氧杂蒽核心结构可以实现近红外发射，特别是杂原子取代（例如用Si取代O）、通过苯环稠合和供体-受体-供体策略进行π扩展，151,170 这些方法扩展了共轭体系并增加了分子刚性。167,171 刚性的增加抑制了分子内非辐射弛豫，支持更稳定的激发态，并根据能隙定律缓解了较长波长处预期的非辐射衰减增强。因此，罗丹明衍生的近红外荧光团与柔性聚甲炔体系相比，可以保持相对稳定的荧光寿命。172 荧光寿命还会受生物环境的进一步调节，例如，罗丹明800在血浆和全血中的寿命长于在水缓冲液中，这与蛋白质结合或高粘度环境中分子运动受限一致，而聚集或不利的溶剂相互作用则会缩短寿命。173

BODIPY荧光团基于与硼中心配位的二吡咯亚甲基核心，形成一个刚性和高度共轭的发色团，具有强吸收、高荧光量子产率和良好的光稳定性。174,175 然而，大多数经典BODIPY染料在可见光范围内发射，且斯托克斯位移较小，限制了它们在深层组织成像中的应用。176,177 为了实现近红外发射，已开发了诸如π扩展、供体-受体取代、刚性化和用氮取代间位碳等结构修饰。特别是，aza-BODIPY衍生物表现出约90至100 nm的红移，使其吸收和发射位于近红外区域。178–181 如图2所示，这些结构特征也决定了荧光寿命行为。刚性的BODIPY骨架抑制了分子内运动并减少了非辐射衰减，与柔性聚甲炔体系相比，支持较长的荧光寿命。取代模式和电子效应（包括推拉结构）可以进一步调节能隙和激发态动力学。182,183 相比之下，引入重原子（如Br或I）增强了系间窜越，并通过促进三重态形成来降低荧光量子产率。182,184 此外，BODIPY衍生体系的荧光寿命可以通过局部环境进行调节。溶剂极性、聚集和生物分子相互作用影响非辐射衰减途径，而pH响应性功能化（例如氨基或酚羟基的质子化）可以诱导结构变化，从而在生物环境中改变荧光行为。185–187 这些特征共同展示了结构设计和环境相互作用如何决定BODIPY基近红外荧光团的荧光寿命。

Alexa Fluor、ATTO、CF和DyLight染料为近红外荧光寿命成像提供了互补选择。表1报告了选定的Alexa Fluor染料的寿命约为0.4至1.5 ns，33,37,159,188–197 ATTO染料的寿命为0.5至3.3 ns，38–45 CF染料的寿命为0.4至3.2 ns，46,48,49,51–53,198–203 列出的DyLight染料的寿命为0.57至1.0 ns。64,66,68,204 这些测量确定了时间对比度的潜在来源，但不同的测量条件使得无法对染料性能进行普遍排名。亮度和光稳定性支持光子收集，而寿命重现性必须针对成像的配方和环境加以确立。205,206

表1 有机外源性荧光团。NS表示在所查阅的来源中未指定。

| 荧光团 | λabs/ex (nm) | λem (nm) | ε (M?1 cm?1) | QY (%) | τ (ns) | 配方/结合状态 | 测量环境 | 测量模式 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (Alexa Fluor) AF 647 | 65033 | 66533 | 270,000 | 33 | 3.33; 1.033; 1.083?; 1.123? | 游离琥珀酰亚胺酯，未结合；33 AF647马来酰亚胺（1.08 ns）；3? AF647–C2马来酰亚胺（1.12 ns）3? | PBS, 22°C（QY）；33 H?O, 22°C（τ）；33 标记缓冲液1（50 mM Tris-HCl pH 7.4–8.0, 50 mM KCl, 5%甘油）3? | TCSPC FLI（共聚焦ALEX显微镜）3? |
| AF 66033 | 663 | 69013 | 32,000 | 37 | 1.2 | 游离琥珀酰亚胺酯；未结合 | PBS, 22°C（QY）；pH 7.5缓冲液, 22°C（τ） | 制造商 |
| AF 68033 | 679 | 7021? | 3,000 | 36 | 1.2 | 游离琥珀酰亚胺酯；未结合 | PBS, 22°C（QY）；H?O, 22°C（τ） | 制造商 |
| AF 700 | 7023? | 7233? | 205,000 | 352?; 33 | 1.033 | 游离琥珀酰亚胺酯；未结合33 | PBS, 22°C（QY）；33 H?O, 22°C（τ）33 | 制造商 |
| AF 750 | 74933 | 77533 | 290,000 | 33 | 1.233; 0.7033; 0.613?; 1.193? | 游离琥珀酰亚胺酯；未结合33,3? | PBS, 22°C（QY）；33 H?O, 22°C（0.70 ns）；33 H?O（0.61 ns）和DMSO（1.19 ns）3? | 光纤扫描时域TCSPC-FLI3? |
| AF 7903? | 784 | 814 | 260,000 | 40 | 0.4 | 反应性胺标记染料 | 5 μM AF790嵌入在1% Intralipid/50 ppm印度墨水中组织模型管中 | 光谱/时域荧光介导断层成像 |
| ATTO 6553? | 663 | 68012 | 5,000 | 30 | 1.87; 3.31 | 游离染料 | H?O（1.87 ns）；EtOH（3.31 ns） | 制造商 |
| ATTO 6653? | 662 | 6801? | 0,000 | 60 | 2.9 | 游离染料 | NS | 制造商 |
| ATTO 678 H?? | 678 | 7081? | 0,000 | 20 | 1.5 | 游离染料 | NS | 制造商 |
| ATTO 680?1 | 680 | 70012 | 5,000 | 30 | 1.69; 3.04 | 游离染料 | H?O（1.69 ns）；EtOH（3.04 ns） | 制造商 |
| ATTO 700?2 | 700 | 71912 | 0,000 | 25 | 1.6 | 游离染料 | NS | 制造商 |
| ATTO 725?3 | 728 | 75112 | 0,000 | 10 | 0.5 | 游离染料 | NS | 制造商 |
| ATTO 740?? | 743 | 76312 | 0,000 | 10 | 0.6 | 游离染料 | NS | 制造商 |
| ATTO Oxa12?? | 662 | 68112 | 5,000 | 30 | 1.8 | 游离染料 | NS | 制造商 |
| CF647 | 650?? | 665?? | 240,000 | 46 | NS | 1.07?? | 游离染料?? | PBS | 制造商 |
| CF660R | 662?? | 6821? | 0,000 | NS | 3.24 | 游离染料 | PBS | 制造商 |
| CF680R | 680?? | 701?? | 140,000 | 49 | NS | 1.22?? | 游离染料 | PBS | 制造商 |
| CF680 | 681?1 | 69821 | 0,000 | NS | 1.23 | 游离染料 | PBS | 制造商 |
| CF750 | 755?2 | 7772? | 0,000 | NS | 0.58 | 游离染料 | PBS | 制造商 |
| CF790 | 784?3 | 80621 | 0,000 | NS | 0.39 | 游离染料 | PBS | 制造商 |
| Cy5 | 647?? | 665?? | 270,000 | 54 | 26??; 1.5, 1.96??; 1.03, 1.23, 2?? | 游离染料；?? Cy5-dCTP?? | 乙醇（1.5 ns），碘化乙烷掺杂的乙醇溶液（1.96 ns）；?? Cy5-dCTP在水溶液中（1.03 ns），干燥表面上（1.23 ns），嵌入薄膜中（2 ns）?? | 光谱/时间分辨单分子TCSPC??,?? |
| Cy5.5 | 678?? | 695?? | 190,000 | 56 | 28;?? | 1, 1.6?? | PBS（QY: 28%），乙醇（QY: 40%）?? | 体内肾脏（1.6 ns）?? | 时域eXplore Optix FLI?? |
| Cy7 | 756?? | 779?? | 200,000 | 59 | 30?? | 161 | 固态Cy7包合物 | 10 μM Cy7包合物嵌入Intralipid模型中?1 | 时域荧光eXplore Optix-MX2系统?1 |
| Cypate | 7750 | 85022 | 24,000 | 35 | 0.46; 0.87 | 游离染料 | MeOH（0.46 ns）；DMSO（0.87 ns）；室温 | 带R928P探测器的TCSPC荧光 |
| DTTCTI750 | 17850 | 17212 | ,00017 | 38?2 | 1.071?; 1.491?; 1.18?3 | 游离染料1?,?3 | MeOH（1.07 ns）；DMSO（1.49 ns），室温1?,?3 | 带R928P探测器的TCSPC荧光1? | PMT基频率域荧光断层成像?3 |
| DyLight 649 | 652?? | 672?? | 250,000 | 65 | 1.8?? | 164 | DyLight-649抗小鼠IgG与表面固定的小鼠IgG结合?? | 银分形基底（玻璃/塑料/硅），覆盖50 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4；偶联物33 nM?? | 共聚焦TCSPC-FLIM?? |
| DyLight 750 | 752?? | 778?? | 210,000 | 65 | 66?? | 0.712?? | DyLight750–HER2特异性Affibody（His6-ZHER2:GS-Cys），1:1染料/蛋白?? | 探针与HER2阳性SK-BR-3细胞结合，PBS中；0.712 ns与未注射探针（～0.710 ns）一致?? | 带Olympus FV1000倒置激光扫描双光子显微镜的TCSPC-FLIM?? |
| DyLight 755 | 754?? | 776?? | 220,000 | 68 | 1.9?? | 0.57?? | DyLight755偶联的铁载转铁蛋白?? | 固定T47D乳腺癌细胞，2小时转铁蛋白孵育和洗涤后?? | 宽场时间门控FLI/FRET，ICCD探测器?? |
| FLUX 647?? | 650 | 6662 | 70,000 | 26 | 1.1 | 游离染料 | NS | NS |
| FLUX 660?1 | 663 | 68021 | 10,000 | 19 | 0.9 | 游离染料 | NS | NS |
| FLUX 680?2 | 674 | 6952? | 0,000 | 18 | 0.9 | 游离染料 | NS | NS |
| FROG-1-NH? (5a)?3 | 718 | 748 | 117,000 | 18 | 0.66 | 游离染料 | DMSO, 室温；700 nm处吸光度<0.15 | MicroTime200共聚焦显微镜TCSPC FLIM |
| FROG-2-NH? (5b)?3 | 718 | 748 | 107,000 | 17 | 0.41 | 游离染料 | DMSO, 室温；700 nm处吸光度<0.15 | MicroTime200共聚焦显微镜TCSPC FLIM |
| HiLyte 647?? | 650 | 6752? | 0,000 | 33 | 1 | HiLyte Fluor 647酸；游离染料 | NS | NS |
| PromoFluor 680 | 690?? | 710?? | 140,000 | 75 | 40 | 0.5?? | 0.405?? | 游离染料?? | EtOH?? | NS |
| PPC-BF? | 77 | 750??? | 30,000至570,000 | 20 | 3.89 | 游离染料和白蛋白结合染料 | 白蛋白/H?O | TCSPC FLI |
| PPC-BPh? | 77 | 810??? | 500,000至530,000 | 5 | 3.35; 2.95 | 游离染料和白蛋白结合染料 | DMSO（3.35 ns）；白蛋白/H?O（2.95 ns） | TCSPC FLI |
| Seta-670-NHS | 78 | 667??? | 180,0007; 27 | 0.42; 2.43 | PB 7.4（QY:7%）；BSA结合（QY:27%） | PBS（0.42 ns）；BSA溶液（2.43 ns） | NS |
| Seta-660-di-NHS | 79 | 661??2 | 220,000 | 11; 49 | 0.9 | PB 7.4（QY:11%）；IgG（QY:49%） | PB, pH 7.4 | NS |
| SeTau-647-di-NHS | 80 | 650??? | 200,000 | 65; 58 | 3.2 | PB 7.4（QY:58%）；IgG（QY:65%） | PB, pH 7.4 | NS |
| SeTau-665-NHS | 81 | 664?12 | 161,000 | 53; 46 | 3.1 | PB 7.4（QY:53%）；IgG（QY:46%） | PB, pH 7.4 | NS |
| SeTau-680-NHS | 82 | 683??? | 295,000 | 24; 30 | 2.9; 3.1 | PB 7.4（QY:24%, 2.9 ns）；IgG（QY:30%, 3.1 ns） | NS | NS |
| SiR650-BG | 83 | 652??? | 116,000 | 37 | 3 | 苄基鸟嘌呤功能化的Si-罗丹明探针 | NS | NS |
| IRDye 700DX | 689?? | 700?? | 170,000 | 84 | 128? | 3.56?? | 帕尼单抗–IR700偶联物（Pan-IR700）（τ）；?? 未结合、BSA结合和血液状态（QY）?? | Pan-IR700在PBS中，浓度2.5、5、20和40 μg/mL，室温（τ）；?? 未结合（QY）?? | 时域FLI eXplore Optix-MX2系统?? |
| IRDye 800CW | 87 | 774??? | 242,000 | 9 | 0.435; 1.1 | 游离染料 | PBS（0.435 ns）；DMSO（1.1 ns） | 带TCSPC SPAD阵列探测的时域介观荧光分子断层成像 |
| 亚甲蓝 | 88 | 668??? | 74,000 | 2; 40 | 0.3至0.6 | 游离染料 | H?O、EtOH和二元溶剂混合物；条件因溶剂系列而异 | 带Perkin Elmer LS 55荧光光谱仪的时间分辨荧光光谱 |
| 吲哚菁绿（ICG） | 780?? | 820?? | 260,000 | 89 | 14?? | 0.521?; 0.511?; 0.971? | 游离ICG1?,?? | H?O（0.52 ns）；MeOH（0.51 ns）；DMSO（0.97 ns）；室温1? | 带R928P探测器的TCSPC荧光1? |
| Cytalux (OTL-38) | 77690 | 79690 | NS | NS | 1.95?? | 叶酸类似物–S0456偶联物；完整靶向试剂；?? OTL-38偶联物在固体模型中?? | 模拟OTL-38的肺部固体模型?? | 宏观时域FLI（TauVIVO）??,?1 |
| ZW800-1A | 772至792?2 | 788至814?2 | 246,000至256,000?2 | 13.5至26.5?2 | 0.64;?3 0.98;?3 0.84?3 | 完整两性离子染料；组织结合/血管状态?3 | 小鼠脑：血管（0.64 ns）；脑淀粉样血管病（0.98 ns）；淀粉样斑块（0.84 ns）?3 | 双光子TCSPC-FLIM?3 |
| ZW800-1C | 779?2,?3 | 772至798?2,?3 | 76,000至225,000?2,?3 | NS | 0.84;?3 1.14;?3 1.27;?3 1.24?3 | 完整两性离子染料；结合到病理蛋白聚集体/组织结构?3 | 小鼠脑：血管（0.84 ns）；神经原纤维缠结（1.14 ns）；脑淀粉样血管病（1.27 ns）；淀粉样斑块（1.24 ns）?3 | 双光子TCSPC-FLIM?3 |

对于多重检测，相关优势在于在选定的探针组内实现可重复的分离。例如，CF660R和CF680R在PBS中报告的寿命分别为3.24 ns和1.22 ns，??,??,?1 使它们成为作为可区分寿命标签的候选者。然而，它们在混合样品或组织中的性能取决于光子计数、相对信号贡献、背景以及偶联或结合后的变化。环境变化可能非常显著，Alexa Fluor 750在水中的寿命报告为0.61 ns，而在DMSO中为1.19 ns。16,33,36,207,208 这种变化使得从固定参考寿命进行分配变得复杂，并促使在预期的生物条件下进行表征。

因此，现有的测量支持根据特定条件选择候选寿命标签，而定量环境传感则需要单独建立的校准和选择性评估。对于FLI-FRET，相应要求是针对相关偶联物和环境的可重复的仅供体衰减，使迁移引起的缩短能够与光物理中无关的变化区分开来。

除上述已建立的荧光团外，最近的碳菁衍生物如CJ215将发射推进到800 nm以上，进入短波红外（SWIR）窗口，在不使用共轭靶向配体的情况下实现高达100的肿瘤背景比。209,210 这种选择性源于CJ215通过磷脂酰丝氨酸结合对凋亡和铁死亡细胞的亲和力，从而允许体内肿瘤特异性成像，并将荧光引导扩展到术后监测。210 表2总结了代表性的长寿命有机近红外荧光团。

表2 长寿命有机近红外荧光团

| 荧光团 | λabs/ex (nm) | λem (nm) | ε (M?1 cm?1) | QY (%) | τ (ns) | 配方/结合状态 | 测量环境 | 测量模式 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 二苯基二噻吩基aza-BODIPY（DPDTAB）211 | 717 | 739 | 114,500 | 47 | 3.71 | 游离染料 | CH?Cl? | TCSPC荧光寿命光谱（Edinburgh OB 920） |
| 720 | 741 | 120,700 | 44 | 3.70 | 游离染料 | 甲苯 | |
| 717 | 738 | 120,500 | 46 | 3.22 | 游离染料 | 四氢呋喃（THF） | |
| 710 | 732 | 108,600 | 46 | 3.60 | 游离染料 | MeCN | |
| 728 | 746 | 118,300 | 20 | 3.40 | 游离染料 | DMSO | |
| 四噻吩基aza-BODIPY（TTAB）211 | 732 | 757 | 103,100 | 12 | 2.23 | 游离染料 | 乙腈 | TCSPC荧光寿命光谱（Edinburgh OB 920） |
| 740 | 764 | 109,900 | 12 | 2.36 | 游离染料 | CH?Cl? | |
| 743 | 768 | 107,500 | 10 | 2.21 | 游离染料 | 甲苯 | |
| 740 | 763 | 107,300 | 12 | 1.95 | 游离染料 | THF | |
| 752 | 775 | 108,000 | 13 | 2.34 | 游离染料 | DMSO | |
| thienoWaza212 | 718 | 739 | 78,600 | 6 | 1.9 | 游离染料 | DMSO | TCSPC荧光寿命光谱 |
| 716 | 728 | 68,300 | 5 | 2.9 | 与BSA结合的染料 | 含5% BSA的PBS | |
| thienoWaza-1 | 212 | 720 | 739 | 88,750 | 5 | 3.0 | 游离染料 | DMSO | TCSPC荧光寿命光谱 |
| 709 | 723 | 41,750 | 5 | 1.1 | 游离染料 | PBS | |
| 716 | 728 | 69,500 | 10 | 2.8 | 与BSA结合的染料 | 含5% BSA的PBS | |
| thienoWaza-2 | 212 | 722 | 740 | 115,000 | 26 | 3.2 | 游离染料 | DMSO | TCSPC荧光寿命光谱 |
| 716 | 725 | 43,000 | 3 | 1.3 | 游离染料 | PBS | |
| 716 | 728 | 68,250 | 5 | 2.9 | 与BSA结合的染料 | 含5% BSA的PBS | |
| thienoWaza-BC | 1212 | 724 | 740 | 108,300 | 20 | 2.9 | 游离染料 | DMSO | TCSPC荧光寿命光谱 |
| 715 | 734 | 105,500 | 10 | 1.5 | 游离染料 | PBS | |
| 715 | 733 | 107,600 | 10 | 1.8 | 与BSA结合的染料 | 含5% BSA的PBS | |
| 715 | 729 | 103,800 | 11 | 1.6 | 与BSA结合的染料 | 含10% BSA的PBS | |
| aza-FL | 213 | 734 | 741 | 229,000 | 66 | 4.3 | 游离染料 | THF? | TCSPC（Horiba DeltaHub） |
| aza-CZ | 213 | 791 | 800 | 237,000 | 49 | 2.3 | 游离染料 | THF? | TCSPC（Horiba DeltaHub） |
| aza-OHCl | 213 | 763 | 776 | 161,000 | 16 | 1.7 | 游离染料 | THF? | TCSPC（Horiba DeltaHub） |
| TPAB（四苯基aza-BODIPY） | 213 | 652 | 677 | 79,000 | 34 | 0.9 | 游离染料 | THF? | TCSPC（Horiba DeltaHub） |
| ADP(CA) | 214 | 696 | 720 | NS | 0.56 | 2.3至3 ns? | 游离染料 | 水 | 聚焦超声激活体积内的时间分辨检测 |
| 742 | 720 | NS | 7 | 45 | | 游离染料 | DMSO | |
| 709 | 720 | NS | 14 | 51 | | 游离染料 | 甲苯 | |
| 678 | 720 | NS | 10 | 51 | | 游离染料 | 二氧六环 | |
| 678 | 720 | NS | 12 | 4 | | 游离染料 | 二氯乙烷 | |
| 678 | 720 | NS | 7 | 93 | | 游离染料 | 乙二醇 | |
| 678 | 720 | NS | 16 | 22 | | 游离染料 | 甘油 | |
| PPCy 4? | 75 | 712 | 777 | 912720 | 5,000 | 128 | 5912? | 4.0212? | 游离染料12? | DMSO（λ, τ）；12? CHCl?（ε, QY）12? | TCSPC FLI12? |
| 77312? | 83012? | 205,000 | 128 | 5912? | 3.8912? | 白蛋白结合染料12? | 白蛋白/H?O（λ, τ）；12? CHCl?（ε, QY）12? | TCSPC FLI12? |
| PPCy 4?′ | 82 | 412? | 84012? | 256,000 | 128 | 5312? | 3.3512? | 游离染料12? | DMSO（λ, τ）；12? CHCl?（ε, QY）12? | TCSPC FLI12? |
| 77312? | 83012? | 205,000 | 128 | 5312? | 2.9512? | 白蛋白结合染料12? | 白蛋白/H?O（λ, τ）；12? CHCl?（ε, QY）12? | TCSPC FLI12? |

? 仅适用于THF；未报告水溶液数据。? 表示随着溶剂极性降低，寿命增加。

在上述已建立的染料家族基础上，最近的努力集中于工程化供体-受体-供体（D–A–D）架构、构象受限骨架、杂原子取代和共轭体系扩展，以将发射红移至近红外和短波红外区域，同时调节非辐射衰减途径，从而提高性能。170,215 例如，包含1,6-二杂苯并蒽二酮（DHPD）端基的氧杂芳基染料表明，结构刚性化抑制了顺反异构化并改善了荧光效率。FROG-1和FROG-2表现出近红外吸收/发射（～718/748 nm），寿命分别为0.66 ns和0.41 ns，量子产率分别为0.18和0.17（相对于HITCI），摩尔吸光系数分别为1.17×10?和1.07×10? M?1cm?1（DMSO中），如图3所示。73 尽管光学性质相似，但微小的结构差异导致不同的生物学行为，FROG-2表现出增强的肿瘤摄取，而FROG-1则经过快速肾脏清除。这些结果突出了结构导向设计在将光物理与生物分布解耦以应用于高级FLI方面的作用。73

图3 在DMSO中的吸收和发射光谱以及FROG-1-NH?（5a）和FROG-2-NH?（5b）的化学结构。经许可转载自文献73，依据CC BY-NC-ND 4.0协议。

除了对细胞摄取和生物分布的影响外，结构导向的修饰还用于扩展近红外FLI可用的寿命对比度。传统的七亚甲基碳菁染料通常表现出低于1 ns的寿命，这可能限制了它们在基于寿命的成像中与内源性组织自身荧光的区分。因此，长寿命近红外荧光团的开发已成为FLI的一个重要目标。如表2所总结的，较长的寿命扩展了可访问的时间对比度，并使探针信号与短寿命背景荧光的分离更加可靠。

与柔性聚甲炔碳菁不同，几种最近开发的近红外荧光团采用了结构刚性的发色团框架，限制了分子内旋转并减少了非辐射衰减。例如，吡咯并吡咯基碳菁衍生物表现出～2至4 ns的荧光寿命127,128，同时在近红外光谱窗口内保持强吸收和发射。类似地，aza-BODIPY衍生的荧光团及相关噻吩稠合类似物在有机溶剂和生理相关环境中表现出接近～4 ns的寿命，同时保持高摩尔吸光系数和量子产率。211–214 这些延长的寿命主要源于图4(a)213和4(b)211所示的刚性和平面发色团框架，这些框架限制了扭转弛豫并抑制了内转换，从而有利于辐射衰减并增加了激发态寿命。这些设计策略突出了如何通过分子刚性和共轭体系的结构控制来延长近红外区域的荧光寿命，并为图4(c)所示的下一代生物和临床成像探针开发提供了框架。

图4 (a) 具有蓝移近红外吸收和发射、高亮度和光稳定性的芴和咔唑稠合aza-BODIPY荧光团的化学结构和代表性光物理性质。经许可转载自文献213，依据CC BY协议。(b) aza-BODIPY核心、TPAB、DPDTAB和TTAB的结构，其中?1–?4表示芳香环与中心发色团平面之间的扭转角。(c) TPAB（黑色）、DPDTAB（红色）和TTAB（蓝色）在乙腈中的荧光寿命衰减曲线。

(b) 和 (c) 面板经许可后转载自参考文献 211。综合来看，这些进展凸显了近红外（NIR）发射有机染料、以及更近期的短波红外（SWIR）发射有机染料作为基于寿命成像的适配性工具的日益增长的重要性，并在代谢传感、微环境成像及图像引导手术等领域展现出新兴机遇。3.2 外源性荧光团：荧光蛋白除合成小分子染料外，远红和近红外荧光蛋白（FP）为细胞和组织成像提供了基因编码的探针。这些蛋白源自几种不同的支架结构。已确立的 iRFP 及若干 miRFP 变体源自细菌光敏色素，而 miRFP670 nano 则由蓝细菌光色素工程化而来，smURFP 则源自异藻蓝素 α 亚基。这些探针以胆绿素 IXα（BV）为发色团，但在结构、寡聚状态和细胞内表现上有所不同。216–218BV 是血红素代谢的天然产物，内源性 BV 的高效结合使部分变体无需补充即可在哺乳动物细胞中发光。然而，内源性的可得性并不能保证不同蛋白或不同生物体系之间的荧光表现一致；细胞亮度取决于蛋白表达量、发色团可得性以及结合效率。光稳定性、寡聚状态和细胞毒性也应针对既定应用加以评估。217–219 表 3 汇总的蛋白发射峰集中在 670 至 720 nm 附近，在既定测量条件下报告了亚纳秒至纳秒级荧光寿命。表 3 荧光蛋白，emiRFP670 的光物理性质与其亲本 miRFP670 相当。荧光团 λabs/ex (nm) λem (nm) ε (M?1 cm?1) QY (%) τ (ns) 制剂/结合状态 测量环境 测量方式 miRFP670 642 220 670 220 87,400 220 14.0 220 1.2 222 大肠杆菌中表达的 BV 结合 miRFP670 221 表达 miRFP670 的大肠杆菌活菌层 221 时域 FLIM 221 emiRFP670 642 216 670 216 87,400 216 14 216 1.53 219 纯化的 BV 结合 emiRFP670 219 PBS，pH 7.4 219 频域 Chronos DFD 系统 219 miRFP670-2 643 216 670 216 103,000 216 13.6 216 1.42 219 纯化的 BV 结合 miRFP670-2 219 PBS，pH 7.4 219 频域 Chronos DFD 系统 219 iRFP670 643 220 670 220 114,000 220 12.2 220 0.93 222 MTLn3 肿瘤细胞中遗传表达的 BV 结合 iRFP670 222 携带表达 iRFP670 的 MTLn3 乳腺肿瘤的小鼠 222 时域 FLI 222 miRFP680 661 216 680 216 94,000 216 14.5 216 1.67 219 纯化的 BV 结合 miRFP680 219 PBS，pH 7.4 219 频域 Chronos DFD 系统 219 iRFP682 222 663 682 90,000 11.2 0.93 BV 结合的 iRFP682 经遗传表达于 MTLn3 肿瘤细胞 携带表达 iRFP682 的 MTLn3 乳腺肿瘤的小鼠 时域 FLI iRFP702 673 220 702 220 93,000 220 8.2 220 0.78 222 MTLn3 肿瘤细胞中遗传表达的 BV 结合 iRFP702 222 携带表达 iRFP702 的 MTLn3 乳腺肿瘤的小鼠 222 时域 FLI 222 miRFP703 674 221 703 221 90,900 221 8.6 221 0.64 221 大肠杆菌中表达的 BV 结合 miRFP703；未光转换基态 221 表达 miRFP703 的大肠杆菌活菌层；pH 与温度未指定 221 时域 FLIM 221 iRFP713 690 220 713 220 98,000 220 6.3 220 0.68 222 MTLn3 肿瘤细胞中遗传表达的 BV 结合 iRFP713 222 携带表达 iRFP713 的 MTLn3 乳腺肿瘤的小鼠 222 时域 FLI 222 iRFP720 702 220 720 220 96,000 220 6.0 220 0.68 222 MTLn3 肿瘤细胞中遗传表达的 BV 结合 iRFP720 222 携带表达 iRFP720 的 MTLn3 乳腺肿瘤的小鼠 222 时域 FLI 222 miRFP720 702 221 720 221 98,000 221 6.1 221 0.65 221 大肠杆菌中表达的 BV 结合 miRFP720；未光转换基态 221 表达 miRFP720 的大肠杆菌活菌层；pH 与温度未指定 221 时域 FLIM 221 smURFP 642 223 672 223 180,000 223 18.0 223 1.40 223 纯化后与 BV 结合的均聚二聚体 smURFP 223 PBS 223 数字频域寿命 Chronos DFD 系统 223 mIFP 683 220 705 220 65,900 220 6.9 220 0.80 219 纯化的 BV 结合 mIFP 219 PBS，pH 7.4 219 频域 Chronos DFD 系统 219 SNIFP 697 224 720 224 149,000 224 2.2 224 0.63 219 纯化的 BV 结合 SNIFP 219 PBS，pH 7.4 219 频域 Chronos DFD 系统 219 基因编码可实现细胞特异性表达，对于适用变体，还可与目标蛋白融合。用于寿命多重成像时，探针选择还应确认衰减速率在目标细胞环境中保持可区分。在我们实验室中，在 AU565 HER2 阳性乳腺癌细胞中表达后，emiRFP670 与 miRFP680 显示出可区分的荧光衰减，支持其在该测试条件下作为寿命多重成像对的潜力 225 [图 5(b) 与 5(c)]。代表性蛋白结构见图 5(a)。将其拓展至其他融合结构、细胞类型或组织环境，需确认表达情况、生物相容性及寿命分离度。图 5 下载 全尺寸图像 (a) 由 BphP 工程化的双结构域 NIR 结构。经许可后转载自参考文献 12。(b) 在 AU565 HER2+ 乳腺癌细胞中表达后测得的 emiRFP670（蓝色）与 miRFP680（红色）荧光衰减。225 (c) 使用 Becker & Hickl HPM-100-50 混合探测器采集的 TCSPC 图像，显示共培养的分别表达 emiRFP670 或 miRFP680 的 AU565 细胞。225 这对 NIR 荧光蛋白的荧光衰减使其可通过寿命多重成像被清晰区分。3.3 外源性荧光团：无机荧光团无机 NIR 荧光团提供了优于有机染料的光稳定性、较大的 Stokes 位移以及可调寿命。具有已表征寿命的荧光团汇总于表 4。其中，半导体量子点（QDs）和金属配合物分子探针是荧光寿命成像（FLI）中研究最多的。NIR 发射的 QD，如 CdTe、CdSe、PbS、CuInS? 和 Ag?S，具有宽吸收和窄发射峰，覆盖 650 至 950 nm。它们的量子产率常超过 50%，寿命为数十至数百纳秒，可实现时间门控和多重寿命成像。231、232、235、237–241 例如，QD705 通过时间门控检测有效抑制了短寿命自发荧光（AF），增强了体内对比度。231 不同 QD 也可通过光谱-时间方式进行区分，用于多重成像和基于 FRET 的成像。228、242–244 然而，Cd2? 或 Pb2? 泄漏导致的潜在毒性以及荧光闪烁仍是挑战。245 表面钝化及合金化或 Ag/Cu 基核材料在保持长寿命、高亮度 NIR 发射的同时改善了生物相容性。232、235、237 表 4 量子点与无机金属配合物荧光团。类别 荧光团 组成 λex (nm) λem (nm) ε (M?1 cm?1) QY (%) τ (ns) 测量环境 测量方式 量子点 QD655 CdSe/ZnS 226 655 226 <670 226 N/A 16.9 至 18 227 13 至 41 228、229 PBS（pH 7.0）中的游离 QD655 228；PBS（pH 7.0）中 228；水溶液中及单个颗粒 229 TCSPC 时间分辨发光 FluoroMax 4 系统 228；共聚焦单颗粒 FLIM 229 QD705 CdSeTe/ZnS 230 <700 230 705 230 N/A >60 230 >20 230 小鼠皮下注射 QD705 231 宽场时间门控荧光成像 231 QD750 CdTeSe/ZnS 232 <740 232 750 232 N/A N/A 12 至 31 232 pH 2 至 10 缓冲液中的 QD750–LS662 偶联物 232；0.1 M NaCl 中用 HCl 或 NaOH 滴定 232 时间分辨荧光衰减测量 232 QD800 CdSeTe/ZnS 233 <760 233 800 233 N/A >26 233 77.8 234 经相转移后分散于水相硼酸盐缓冲液中的 L-组氨酸封端 QD800 234 时间分辨光致发光衰减光谱 234 — ZnCuInSe/ZnS 235 659 235 800 235 N/A 20 至 35 235 τshort：25 至 60，235 τlong：134 至 177 235 水中的配体交换 QD：τshort = 25 ns 235、τlong = 134 ns 235；电穿孔 24 小时后的 HeLa 细胞胞质中 235：τshort = 60 ns 235、τlong = 177 ns 235 宽场时间门控荧光衰减成像 235 金属配合物探针 Zn-OMeNc 锌酞菁 236 794 236 804 236 N/A N/A 1.7 236 DMSO 中的游离 Zn-OMeNc 236 溶液相 TCSPC 荧光衰减光谱 236 Zn-NMe?Nc 锌酞菁 236 800 236 811 236 N/A N/A 0.86 236 DMSO 中的游离 Zn-NMe?Nc 236 溶液相 TCSPC 荧光衰减光谱 236 Zn-NMe?Nc 锌酞菁 236 732 至 781 236 801 至 804 236 N/A N/A 2.4 至 5.69 236 水中的游离 Zn-NMe?Nc 为 2.4 ns 236；DMSO 中的游离 Zn-NMe?Nc 为 5.69 ns 236 溶液相 TCSPC 荧光衰减光谱 236 IRDye 700DX 硅–酞菁衍生物 ? 866 86 708 86 700 86 N/A N/A 2.85 至 3.56 86 PBS 中浓度为 2.5 至 40 μg/mL 的 Panitumumab–IR700 86：平均寿命 3.56 ± 0.081 ns 86；A431 细胞沉淀，与 Pan–IR700 孵育 24 小时后接受 30 J/cm2 NIR 光免疫治疗 86：2.85 ns 86 使用 eXplore Optix–MX2 系统进行时域荧光寿命成像 86 对于 QD，λex 表示宽带激发范围的上限；QD 在该值以下的所有波长处均可被有效激发。? IRDye 700DX 是一种硅-酞菁偶联染料，在表 1 的外源性有机荧光团中亦有列出。金属配合物 NIR 荧光团，如金属酞菁（ZnPc、AlPc、SiPc）及相关叶绿素，具有强的 Q 带吸收（630 至 690 nm），发射位于 700 至 800 nm 附近。246、247 这些分子的寿命为单指数，在 3 至 7 ns 之间，取决于溶剂极性、聚集状态。246、248、249 硅酞菁表现出特别长的荧光寿命（6.7 至 7.3 ns）和高的光稳定性，使它们在 FLIM 中颇具前景。246、248 金属化酞菁的寿命成像还可揭示聚集或蛋白结合等微环境影响；ZnPc-白蛋白偶联物保持固有的纳秒级寿命，而脂质体制剂则表现出聚集导致的猝灭。249–251 3.4 内源性荧光团与 NIR 自发荧光内源性荧光团是原生生物分子，无需施加外部探针即可提供固有的荧光对比。与用于 NIR 成像的大量外源性荧光团相比，在 NIR 光谱范围内具有明确表征发射与荧光寿命特征的内源性荧光团较少，因为大多数内源性荧光团主要在紫外（UV）或可见光区域发射。表 5 汇总了与 NIR FLI 相关的代表性内源性荧光团，包括使用 NIR 双光子激发研究以及发射延伸至 NIR 光谱范围的荧光团。表 5 内源性荧光团。荧光团 λex (nm) λem (nm) ε (M?1 cm?1) τ (ns) 测量环境 测量方式 黑色素 740 至 760 94、95 780 至 900 95、96 265 至 583 97 0.2 至 0.4 ?；1.8 至 2.5 ? 94–96 人皮肤和毛发 94；色素沉着皮肤与黑色素瘤标本的体内与离体研究 95 多光子 FLIM 与多光子激光层析 94、95；FLI 眼内窥镜 96 原卟啉 IX（PpIX） 635 98 700 99、100 160,000 98、100 3 99；6 101；16 101 离体人胶质瘤组织（3 ns）99；ALA 诱导的、活体 MAT-LyLu 大鼠前列腺腺癌细胞中的 PpIX（6 ns）101；DMSO 中的 PpIX（16 ns）101 宽场时域 FLIM 99；双光子 TCSPC-FLIM 与电子倍增型相机寿命光谱 101 NADH 740 至 800 102、103 N/S N/S 0.5 ?；2.1 ? 102 生理盐溶液 102 多光子激发荧光寿命测量 102；用于体内脑内 NADH 测量的双光子 FLIM 103 血红蛋白 700 至 800 102、104 N/S 602 至 2970 105、106 0.3 ?；1.2 ? 102、104、107 生理盐溶液中 102 三阶谐波产生的多光子激发荧光显微镜 102；时间分辨荧光光谱 107；双光子 FLIM 104 胆红素 1230 650 至 800 108、109 152（于 590 nm）109 0.5 ?、2 ?；0.3 ?、1.5 ? 108 人肝细胞癌组织（0.5 ?、2 ? ns）；配对的非肿瘤肝组织（0.3 ?、1.5 ? ns）108 双光子 FLIM 108 脂褐素 1060 110 604 至 679 110 N/S 0.1 至 0.5 110 未经药物处理及经药物处理的癌细胞、肿瘤球、类器官及三维肿瘤切片 110；活细胞成像期间温度维持在 37°C、CO? 浓度为 5% 110 双光子 TCSPC-FLIM 110 核黄素 N/S 700 至 800 102 6737 至 7200 111、112 4 102 生理盐溶液中的核黄素 102 多光子激发荧光测量 102 上标字母将寿命值与其对应的测量环境相链接。NS 表示所核查文献中未指定。QY 未报告；对大多数内源性 NIR 发射体而言，其值通常低于 1%。? 表示短寿命分量（τ?）。? 表示长寿命分量（τ?）。黑色素是一种广谱色素，存在于皮肤、毛发及视网膜色素上皮中，其量子产率极低，但具有可检测的延伸至 NIR（800 至 900 nm）的发射尾。97、252–255 时间分辨及自适应光学眼内窥镜研究已证实黑色素是 NIR 荧光的主要内源性来源。256、257 荧光寿命分析揭示了黑色素复杂的衰减动力学。天然的及合成的真黑色素（黑色素最常见形式）均表现出异质性多指数衰减，主要由一个超快分量（0.2 至 0.4 ns）主导，伴随延伸至 1 ns 的较慢分量；而在富含类黑素的组织中，这些寿命偶尔可达 2 至 3 ns。94、96、253 相比之下，人工 3,4-二羟基-L-苯丙氨酸黑色素（DOPA-melanin）类似物的寿命集中在约 1.2 ns 附近。94、96、253 这些结果表明，黑色素荧光主要源自一个宽而无可分辨特征的发射尾，而非离散的电子跃迁。尽管其强度较低，黑色素仍能在生物成像中稳定提供可测的 NIR 寿命对比，尤其是在视网膜成像研究中，在色素沉着视网膜区域已观察到寿命差异。258 原卟啉 IX（PpIX）是血红素生物合成途径中的四吡咯中间体，是一种固有的荧光内源性分子。在生理条件下，PpIX 作为正常细胞代谢的一部分以低浓度存在，但由于血红素合成途径失调，在某些肿瘤类型中已报道其内源性水平升高。259–261 在紫或蓝色激发下，PpIX 产生特征性的红色荧光。从光物理角度而言，所报道的 PpIX 荧光寿命介于约 3 至 16 ns 之间。99、100、262–264 这种纳秒级衰减动力学将 PpIX 与主导大量内源性自发荧光背景的短寿命分量区分开来，使其成为一种独特的内源性寿命对比来源。其他内源性分子，包括 NADH 和黄素等代谢辅因子、血红蛋白和细胞色素等含血红素的蛋白，以及胆红素和脂褐素等色素，也对组织 AF 背景有所贡献。然而，这些物种主要在紫外或可见光谱范围发射，其 NIR 内源性发射微弱或可忽略。其荧光衰减动力学常由超快非辐射弛豫过程或环境猝灭所主导，导致其对 NIR 荧光寿命对比的直接贡献有限。21、265–269 因此，尽管这些发色团可影响时间分辨 AF 测量，它们一般作为背景贡献者，而非主要的 NIR 发射体。综上，内源性荧光团界定了生物组织的固有 AF 景观。尽管这些物种的 NIR 发射通常较弱且往往源于光谱尾，但其光谱与寿命特征决定了 FLI 实验中遇到的背景信号。理解这些内源性信号，为解读寿命测量以及设计能在生物成像中获得稳健、特异性对比的工程化 NIR 荧光团提供了重要背景。4. NIR 荧光寿命成像的应用 4.1 多重成像综合而言，跨越 NIR 范围的内外源性荧光团，从小分子有机染料、荧光蛋白到无机纳米材料，提供了丰富的寿命特征和光物理行为。这些荧光寿命的差异为超越单色可视化、迈向多维光学分析的高级成像策略奠定了坚实基础。基于这些固有的寿命对比，多重 FLI 已成为在复杂生物体系中同时分辨多种分子物种的关键成像策略。NIR 窗口的多重 FLI 通过利用互补的光谱与时间维度的对比，可同时检测多种探针。当荧光团的发射曲线充分分离时，光谱分辨是有效的；而寿命提供了一条正交的对比维度，在荧光衰减特征差异足够大的情况下，可以区分光谱重叠的荧光团。270–273 寿命基多重成像已在体外和组织中得以实现，其中光谱信号重叠的荧光团可通过其荧光衰减特征被区分 [图 6(a)]。274 在多重体内成像场景中，寿命对比的优势尤为显著，因为基于强度的方法在根本上受限于光谱重叠。一个代表性示例见图 6(b)，29 其中共注射的骨靶向（OsteoSense，τ ≈ 0.65 ns，λem = 835 nm 275）与肾靶向（ZW800，τ ≈ 0.5 ns，λem = 835 nm）探针在连续波强度图像中信号重叠，使解剖结构难以区分。相比之下，荧光寿命衰减幅度图清晰地分辨出各探针不同的空间分布，准确勾勒出骨骼结构和肾脏积聚区域。这些研究证明了在其各自实验条件下 NIR 寿命多重成像的可行性。29、274 然而，某一对探针的分离并不能确立成功解混所需的最低寿命差值。例如，OsteoSense 与 ZW800 之间报告的约 0.15 ns 差值，应结合该研究中所使用的采集、参考测量与分析方式来解读。29 实际分辨能力取决于所测得的衰减特征及其变异性，连同光子计数、背景以及各探针的相对信号贡献。图 6 下载 全尺寸图像 (a) 体外及组织中的寿命基多重成像。

经许可改编自参考文献274，依据Optica出版集团开放获取出版协议。 (b) 骨靶向染料OsteoSense（红色）和肾脏靶向染料ZW800（绿色）共注射后的体内和原位荧光强度图（左列）以及相应的荧光寿命衰减振幅图（右列）。比例尺=1 cm。经许可改编自参考文献29，依据Optica出版集团开放获取出版协议。

因此，多路复用效果应通过混合样本中探针分配的准确性和可重复性来评估。相关证据包括通道间串扰、已知信号贡献的恢复，以及在强信号存在下检测弱成分的能力。参考衰减应代表被成像的分子制剂和环境，因为偶联、结合和聚集会改变溶液中的分离度。对于宏观成像，还应在相关深度和散射条件下评估性能。报告这些条件及相应不确定性将有助于读者区分已验证的多路复用性能与表格中寿命差异所暗示的潜在性能。在无法获得此类评估的情况下，结论应限于实际测试的探针组合和条件。

4.2. 基于FRET的分子相互作用成像

FRET使FLI能够检测约2到10 nm内的分子邻近性。从激发供体到光谱兼容受体的能量转移会缩短供体荧光寿命，提供蛋白质相互作用、受体组织和配体或抗体-靶标结合的读出。5,276–278 将FRET应用于完整动物具有挑战性，因为组织散射和低光子计数使供体衰减成分恢复变得复杂。279,280 近红外激发和发射减少组织自荧光并改善光子穿透力。基于寿命的检测通常比基于强度的FRET对探针浓度、激发异质性、组织衰减和供体-受体-发射串扰的敏感性更低。280,281 这些特性使近红外荧光寿命检测成为活体动物宏观FLI-FRET（MFLI-FRET）的关键使能组成部分。278,281,282

在FLI-FRET中，测量的供体衰减可能包含经历FRET的供体分子和未经历FRET的供体分子的贡献。278,279 双指数衰减模型可估算短寿命成分的相对振幅，称为FRET供体分数（FD），以及FRET效率，如公式(4)计算。公式(4) E=1?τDA/τD，其中τD是未猝灭的供体寿命，τDA是FRET缩短的寿命。208,278–280,283 这些参数提供互补信息：FD是经历FRET的探测供体群体的振幅衍生估计值，而E描述经历FRET的供体群体的寿命减少，对供体-受体距离和取向敏感。应为每种探针制剂在相关标记和环境条件下建立仅供体参考，并在这些条件发生实质性变化时重新测量。280,284 解释还需考虑供体与受体的比率、标记程度和位点、探针亲和力、表位几何形状、受体组织和靶标可及性。27,69

细胞中的近红外FLIM-FRET显微镜测量可以建立仅供体寿命、优化标记和供体与受体比率、测试测定特异性，并将短寿命成分与受体相关相互作用和细胞分布联系起来。284,285 宏观MFLI-FRET随后使用这些表征的探针对和寿命参数对完整肿瘤和活体动物进行宽场成像。208,278,285 因此，显微镜FLIM-FRET为宏观测量提供生物和光物理验证，而MFLI-FRET使经验证的相互作用在完整肿瘤和小鼠上进行非侵入性纵向成像成为可能。3,285

初始近红外MFLI-FRET研究使用供体标记和受体标记的转铁蛋白来测量肿瘤异种移植中转铁蛋白受体的结合。69,208,278 后续研究使用AF700/AF750标记的曲妥珠单抗对来量化HER2阳性细胞和完整肿瘤中的HER2结合。284,285 在这些测定中，供体强度主要反映探针递送和积累，而FD识别经历受体相关FRET的供体标记探针的分数。280,284 非荧光受体IRdye QC-1减少了受体发射串扰，并实现了肿瘤葡萄糖代谢和受体-配体结合的复用成像。286 结合显微镜FLIM-FRET和全动物MFLI-FRET进一步证明了在血管化差、胶原丰富的肿瘤中曲妥珠单抗-HER2结合减少，尽管HER2表达相当，宏观发现得到了离体免疫组织化学的独立支持。285 这些研究表明，经验证的近红外FLI-FRET测定能够区分受体相关结合与体内总探针积累。

定量MFLI-FRET面临低光子计数、组织依赖性时间分散、空间变化背景、光子迁移和处于不同生物状态的探针群体的挑战。279,280 这些因素可能会使寿命成分和FD产生偏差，如果仪器响应、参考寿命、光子传播和衰减模型没有得到适当表征。正在开发高空间频率结构照明和亚扩散重建方法来抑制表面荧光并提高MFLI的深度特异性。15

4.3. 微环境传感

除了区分荧光团和检测分子相互作用外，近红外FLI还可以利用依赖于环境的荧光衰减变化来报告局部生化与生物物理条件。这些应用依赖于激发态衰减对特定环境变量有反应的荧光团，或对分子结合和细胞微环境变化有反应的荧光团。

寿命基于环境传感的直接例子是肽功能化CdSe/ZnS量子点（CdSe/ZnS-PH），其中D-青霉胺-组氨酸表面配体的质子化在酸化时产生荧光寿命的可逆降低[图7(a)]。287 在C3H10T1/2细胞中，该探针在pH 6.4到7.2之间表现出线性寿命响应，灵敏度约为每pH单位2.0 ns，能够确定细胞内pH为6.97±0.14。其相对较长的细胞寿命（10.84±0.30 ns）在24小时内保持稳定，支持有限的短寿命细胞自荧光干扰的纵向细胞内测量。287

亚甲蓝（MB）说明了荧光寿命如何反映多种环境影响。在均匀介质和DNA结合复合物中的测量显示了对溶剂特性和分子结合敏感性。88,94 在细胞FLIM中，所研究乳腺癌细胞中的较长衰减成分约为0.75 ns，而正常上皮细胞中约为0.89到0.95 ns，如图7(b)所示。288 这些差异提供了所研究细胞群体之间的对比。然而，由于测量未分离个体物理化学变量，无法将观察到的对比唯一归因于极性、粘度或结合。因此，MB寿命应解释为这些条件下细胞环境的综合读出。

量子点和MB研究说明了不同的证据要求。CdSe/ZnS-PH的校准寿命-pH关系支持在测试范围和条件下定量估计pH，287 而MB结果支持区分生物状态，而未建立唯一的物理化学原因。量子点探针在627 nm附近发射，因此提供了与近红外传感器开发相关的可见发射方法学示例，而非近红外范围内的直接演示。定量近红外传感器同样需要校准响应、表征不确定性和评估竞争影响。旨在区分生物状态的探针需要可重复的对比，即使在对比的分子起源仍未完全解决的情况下。

4.4. 临床转化

上述微环境敏感的寿命行为在使病理组织与周围非病理组织区分时变得具有临床相关性。当前转化证据包括寿命分辨的组织表征和继续主要依赖荧光强度的已建立荧光引导手术应用。临床批准的荧光团和靶向荧光试剂定义了近红外成像的转化基准，代表性应用如图8(a)所示。32

4.4.1. 寿命分辨的肿瘤成像

内源性胆红素提供了近红外光谱范围下边界附近寿命基于病理组织表征的示例。在1230 nm双光子激发下，胆红素二聚体产生约660 nm的红色荧光。108 在冷冻切片肝脏组织中的时间分辨测量揭示了分化不良肝细胞癌（HCC）与相应非肿瘤区域之间改变的胆红素寿命分布[图8(b)]。108 短寿命成分从非肿瘤组织中的约0.3 ns增加到肝细胞癌中的约0.5 ns，表明对疾病相关的胆红素聚集、分子结合和局部组织微环境变化的敏感性。

PpIX相关荧光已用于上皮病变的光学检测和早期癌症诊断。289,290 然而，自然发生的PpIX荧光信号通常较弱，在许多临床成像应用中通过施用5-氨基左旋色氨酸（5-ALA）得到增强，5-ALA是一种代谢前体，增加细胞内卟啉产生并导致PpIX在肿瘤组织中的优先积累。259–261,291 在紫色或蓝色激发下，积累的PpIX产生特征性红色发射，使恶性组织的直接可视化成为可能。在恶性胶质瘤患者中的随机多中心III期试验表明，5-ALA荧光引导手术改善了完全切除率和6个月无进展生存期，与常规白光手术相比。6个月无进展生存期为41.0%与21.1%，绝对差异为19.9个百分点。292

除了这种已建立的基于强度的使用外，PpIX的纳秒尺度衰减动力学使寿命基于对比机制能够补充传统强度成像，并推动FLI方法以改善恶性与非病理组织之间的区分。31,99,293,294 如图8(c)所示，31 恶性区域表现出比非病理组织延长的PpIX荧光寿命，提供了残留肿瘤相比传统强度成像的改善对比。

吲哚菁绿（ICG）于1959年获FDA批准，仍然是最广泛使用的用于灌注评估和荧光引导手术的近红外染料。30,274,295–302 一项系统施用ICG后获得的患者来源手术标本的研究证明了多种实体瘤类型中恶性与非癌组织之间的荧光寿命对比。肿瘤相关ICG寿命长于相应非癌组织，组织病理学比较支持报告的分类准确率超过97%。这些发现证明了在切除人体组织中的寿命基于肿瘤区分，并支持ICG寿命成像用于手术引导的进一步发展。前瞻性术中研究需要确定这种对比是否改善边缘评估和手术结果。30

4.4.2. 基于强度的荧光引导手术

已建立的基于强度的荧光引导手术提供了转化近红外寿命成像的临床背景。内源性甲状旁腺自荧光使组织识别无需施用探针成为可能，而基于ICG的成像说明了手术对比如何取决于生物分布、清除和成像时间。110–112,252–256 靶向和可激活试剂进一步展示了将荧光定位到病变组织的策略。262–274,278–280 这些应用确立了探针递送和手术可视化的实际需求，但其临床性能未确立荧光寿命的额外诊断价值。

可用的寿命测量尽管如此还是确定了进一步调查的机会。IRDye 800CW报告在PBS中寿命约为0.435 ns，在DMSO中为1.1 ns，16,87 而针对培单抗偶联的IRdye 700DX报告寿命为3.56 ns。84–86 LS301报告在水中寿命为0.21 ns，在胶质瘤细胞中为0.84 ns，282,283 而ZW800-1C显示出标记神经病理结构之间的寿命差异。93 这些测量提供了制剂和环境特异性的观察；它们不应被视为可互换的内在染料常数或已验证的临床寿命区分证据。

探针表征与应用模拟测量之间的区别对于Cytalux尤其重要。在模仿OTL-38的肺固体体模中报告寿命约为1.95 ns。90 此数值表征了报告的体模测量，不应在未确认发射物质和制剂的情况下赋予Cytalux本身。同样，其他手术探针的靶向或激活机制未确立其适用于寿命成像的适宜性，当它们的衰减特性未表征时。

转化优先级因此是确定寿命测量是否在临床相关条件下提供超出荧光强度的可重复信息。这需要表征施用的制剂、针对相关生物或病理终点进行验证，并直接评估寿命对比的附加值。

5. 成像仪器和荧光寿命分析

5.1. 近红外FLI的采集模式

荧光寿命测量通常使用时间域或频率域采集方法实施。时间域方法采样脉冲激发后的时间荧光响应，测量的荧光强度作为时间的函数绘制，如图9(a)所示。

频域方法测量周期性调制激发下荧光的相位延迟和调制响应，可在相量空间中表示，如图9(b)所示。2,59

**图9** 下载全尺寸图片

时间和频域荧光寿命测量的典型输出。（a）激发响应和典型荧光衰减曲线作为时间的函数显示。（b）典型的频域相量图，展示了根据相位和调制响应分布的荧光寿命信号。

两种主要的时间域方法是时间相关单光子计数（TCSPC）和时间门控采集。TCSPC记录每个检测到的荧光光子相对于激发脉冲的到达时间。在重复的激发周期中累积的光子到达事件形成一个表示荧光响应的时序直方图。270,303,304 由于仅记录单个光子事件，计数率必须得到控制以限制堆积效应，堆积效应发生在单个激发周期内多个光子到达但仅记录第一个事件时。305 激发周期也必须足够长以避免连续激发脉冲产生的信号之间出现显著重叠。

时间门控采集则在一系列与激发脉冲同步的时间窗口内积分荧光光子。每个门控在定义的持续时间和延迟时间内采样荧光信号，顺序移动门控产生跨越荧光响应的一系列时间分辨测量值。306–309 门控宽度、时间间隔和采集门控数量决定了时间采样和光子收集。窄而紧密间隔的门控提供更详细的时间信息，而较宽或较少的门控增加光子收集和采集速度。

频域采集使用周期性调制激发而非直接采样时间荧光响应。发射的荧光跟随激发调制，但由于有限的激发态持续时间而表现出相位延迟和调制深度降低。310,311 这些测量可以在一个调制频率或跨多个频率进行，以更完整地表征频率响应。

因此，TCSPC提供密集采样的光子到达分布，但可能需要更长的采集时间和对计数率的仔细控制。时间门控采集实现跨成像视野的并行时间采样，其时间信息由门控配置决定。频域采集记录相位和调制信息而不直接获取完整时间衰减。这些方法的选取取决于预期的寿命范围、可用光子计数、所需采集速度和成像视野。

## 5.2 检测器技术和成像架构

近红外FLI的实现取决于检测器特性，包括近红外灵敏度、光子探测效率、时间响应、暗计数率、有效面积以及与逐点扫描或宽场采集的兼容性。这些特性对于分辨近红外荧光团常见的弱发射和亚纳秒寿命尤为重要。检测器技术按其物理架构而非采集域进行讨论，因为相同的检测器类型结合适当的定时、门控或调制电子器件时可能支持不同的寿命测量方案。

光电倍增管（PMTs）和混合光电探测器是TCSPC测量中成熟的光子探测器，通常用于逐点扫描或多通道成像系统，例如，图10(a)中所示的具有16个光谱通道的TCSPC FLIM系统。270 其时间分辨率主要由渡越时间展宽和相关定时电子器件决定，而光谱灵敏度由光阴极材料决定。315,316

**图10** 下载全尺寸图片

(a) 十六波长通道FLIM装置。经许可复制自文献270。（b）使用瑞士SPAD3（SS3）相机在宽场装置中进行单次快照宏观FLI。（c）模拟组织的鼠形幻影体包含两个嵌入的试管，分别填充AF700在PBS和DMSO中，通过面板(b)中的成像系统进行成像，以演示动态运动条件下的宏观寿命映射。面板(b)和(c)均经许可改编自文献312，采用CC BY 4.0许可。（d）经口机器人手术中使用ICG荧光成像定位乳头状甲状腺癌咽后淋巴结转移。白色光视图和近红外荧光视图使用Da Vinci SP系统的FIREFLY成像模式。经许可改编自文献313，采用CC BY 4.0许可。（e）癌症视觉护目镜成像系统和数据采集工作流程的示意图，用于定量近红外荧光引导手术。图中描绘了可穿戴成像平台和用于手术过程中实时荧光可视化的相关数据采集流程。经许可改编自文献314，采用CC BY 4.0许可；原图中选定的组件在署名后使用。

对于宽场时间门控成像，ICCD相机将像增强器与CCD或相关相机传感器相结合。增强器包含光阴极、微通道板和荧光屏，光阴极上的快速电压切换可实现亚纳秒光学门控。306,307,309,317 ICCD提供高光学增益和大的连续成像面积，但需要真空管组件，并且可能受微通道板增益变化、荧光屏余辉和相机读出噪声的影响。318,319

较新的系统直接在固态CMOS图像传感器内实现时间门控，避免了ICCD相机使用的外部像增强器。一个例子是tauCAM系统，该系统采用水冷128×128电流辅助光子采样器（CAPS）像素阵列，设计用于宏观FLI。CAPS传感器采用商业350 nm CMOS工艺制造，电流辅助实现基底内光生载流子的快速传输和时间门控。其亚纳秒门控和超过40%的近红外观测量子效率支持短近红外寿命的测量，同时多曝光成像和非破坏性读出将可用动态范围扩展到超过100 dB。320,321

除基于CAPS的相机外，SPAD阵列代表了第二个主要的CMOS兼容时间分辨成像架构。SPAD阵列是固态探测器，提供单光子级别的成像能力，具有无与伦比的光子计数和时间分辨性能。322–325 最近在制造工艺方面取得了重大进展，使单个SPAD像素能够集成到足够大的阵列中以用作完整的成像传感器。然而，由于TCSPC数据采集相关的复杂电子器件和大数据流——这是单检测器系统的主要技术——基于TCSPC的SPAD相机通常仅限于小格式。305,326,327 相比之下，时间门控SPAD阵列更容易扩展到更大的视野，并提供显著更高的全局光子计数率能力。最近的商业系统，如SPAD512S（或SPAD5122），实现了FLI，具有相对高的像素密度（512×512像素）、单光子灵敏度和高达100,000 1位帧/秒的读出速度。尽管门控宽度相对较宽，但此类SPAD阵列已被证明能够实现短寿命的定量FLI。16,328,329

CMOS制造使SPAD阵列能够在与探测器阵列相同的芯片上集成光子探测和处理电子器件，如雪崩淬灭和再充电电路、时间门控或光子定时电路以及本地计数器或存储器。这种集成支持并行光子探测和高速成像，但附加电路与光敏区域竞争并增加读出复杂性，在像素尺寸、填充因子、定时能力和数据吞吐量之间产生权衡。330 暗计数、后脉冲、串扰、死时间和像素间响应变化仍是重要的性能考量。330–332 一个代表性实现是瑞士SPAD3（SS3）相机，采用大格式时间门控SPAD阵列和双门控采集架构。312 该系统同时记录用户定义时间门控（G2）内的荧光和整个激光重复周期（INT）内的荧光，在单次采集中提供时间关联的门控和强度测量。当集成到宽场宏观FLI系统中时，SS3支持跨大视野的单次快照采集，如图10(b)所示。312

另一种新兴的、对时间分辨荧光成像具有强有力潜力的检测器技术是超导纳米线单光子探测器（SNSPD）。SNSPD由在其临界温度以下运行并偏置在超导转变附近操作的超导纳米线组成，使得单个光子的吸收产生可测量的电脉冲。333–335 由于其高的单光子灵敏度、低暗计数率、无后脉冲操作和极低的定时抖动，SNSPD对于低光和高速荧光测量特别有吸引力，特别是在近红外区域，其中荧光团通常表现出弱发射和短激发态寿命。336,337 尽管它们在FLI中的应用仍然有限，但SNSPD已经开始在基于荧光的测量中进行探索，如时间分辨光致发光、单分子检测、荧光相关光谱和深组织短波红外显微镜，在这些领域中，它们改进的时间精度和信噪比性能可以提供相对于传统近红外光电倍增管探测器的明显优势。337–339 然而，尽管具有这些令人鼓舞的特性，将SNSPD广泛集成到实用FLI平台中仍然具有挑战性。它们的运行需要低温冷却和专用读出电子器件，而有效的光子收集通常受限于小的有效面积、有限的填充因子、光学耦合损耗、偏振相关探测效率和探测器死时间。337,338 此外，当前的SNSPD实现往往是高度定制化的研究系统而非广泛部署的成像解决方案，将这些探测器扩展为适合宽场、内窥或临床集成荧光成像的大面积或高像素阵列格式仍然是一个重大的技术挑战。337,338

总之，这些检测器技术支持从逐点扫描显微FLIM到宽场和宏观近红外FLI的各种架构。PMT和混合检测器系统仍广泛用于扫描或多通道TCSPC，而ICCD、CAPS和SPAD相机实现跨更大成像视野的并行采集。

迄今为止，新兴的荧光引导手术（FGS）系统主要专注于实时基于强度的近红外可视化。基于强度的手术平台也说明了临床FLI集成的实际需求。FIREFLY系统313（如图10(d)所示）演示了在机器人手术工作流程中的荧光可视化，而癌症视觉护目镜314（如图10(e)所示）说明了免手持的采集几何体显示和控制。302,340,341 上述实现提供基于强度的引导；它们对FLI的相关性在于这些集成特性。将此类平台扩展到寿命成像还将需要兼容的激发和定时硬件、仪器响应校准以及足够的光子收集，以在可用采集时间内实现有用的寿命精度。因此，临床可用性应通过采集时间和完整寿命映射的可靠性来评估，同时考虑空间分辨率、视野以及与手术工作流程的兼容性。

## 5.3 荧光寿命估计与计算分析

在时间分辨采集之后，荧光寿命分析将测量的时间域或频域信号转换为定量寿命参数。对于时间域测量，每个像素检测到的荧光衰减可表示为方程(5)：

$$I_{meas}(t) = \text{IRF}(t) \otimes \left[\sum_{i=1}^{N} A_i e^{-t/\tau_i}\right] + B(t)$$

其中 $A_i$ 和 $\tau_i$ 分别是第 $i$ 个组分的指前幅度和荧光寿命，$B(t)$ 表示背景贡献，$\otimes$ 表示与仪器响应函数（IRF）的卷积。

方程(5)假设线性激发和检测，光子在样品中传播引起的时间分散要么可以忽略，要么独立校正。在这里，IRF考虑了仪器展宽，包括激发脉冲和检测定时响应。在宏观组织成像中，激发和发射光子迁移可能引入额外的延迟和展宽，这些取决于组织光学特性、荧光团深度和测量几何结构。仅使用仪器IRF的再卷积不能考虑这些贡献。当传播效应实质性地影响分析的衰减时，寿命恢复需要包含光子传输的模型或在代表性测量条件下验证的校正。没有此类验证，恢复的参数应报告为表观寿命，并承认光子迁移的潜在贡献。

单指数模型通常对于均匀环境中的荧光团已足够，而当多种荧光团、构象状态、结合环境或AF组分贡献于测量的衰减时，可能需要多指数模型。59,342,343

衰减参数通常使用非线性最小二乘拟合或最大似然估计进行估计。与测量的IRF的再卷积对于与仪器响应时间宽度相当的亚纳秒寿命近红外荧光团尤为重要。逐像素拟合提供空间寿命映射，而全局拟合可以约束跨像素、光谱通道或重复测量的选定寿命组分以减少异质数据中的参数简并性。342 根据衰减模型，报告的输出可以包括单独的寿命组分和幅度、幅度加权平均寿命或每个组分的分数贡献。

对于频域测量，寿命从相对于调制激发的荧光相位延迟 $\phi$ 和解调因子 $M$ 计算。对于理想单指数衰减，对应的相位和调制寿命如方程(6)和(7)所示，其中 $\omega$ 是角调制频率。对于这些单指数衰减，预期这些量之间一致，而它们的分歧可能指示异质或多组分荧光。59,310

方程(6)：
$$\tau_\phi = \frac{\tan(\phi)}{\omega}$$

方程(7)：
$$\tau_M = \frac{\sqrt{M^{-2} - 1}}{\omega}$$

近期减少时间门控FLI采集和处理时间的努力探索了快速寿命确定（RLD），该方法从少量时间门控中采集的荧光信号估计表观寿命，而不是通过迭代衰减拟合。当结合稀疏或同时门控采集时，RLD可以支持快速或单次快照寿命成像，如图10(c)中所示的动态幻影体测量所证明的。

RLD通常假设单指数衰减行为，且对背景减除以及所选定时间门的时序和宽度仍然敏感。312基于相量图的寿命和AF解混提供了一种正交方法，它根据纳秒级衰减动力学来区分荧光团，即使在发射光谱重叠时也能实现准确区分。271,344在相量分析中，每个荧光衰减被转换到二维相量空间中的归一化正弦和余弦坐标中，如图11(a)所示。345理想的单指数衰减位于通用半圆上，而寿命组分的混合物则根据其相对贡献占据半圆内部的位置。这种图形表示方法无需显式拟合预定义的多指数衰减模型，即可快速识别和分离寿命种群。342,346

图11
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(a) 传统相量分析和(b) 基于相量图的U-Net解混TCSPC-FLIM成像数据。经许可转载自参考文献345。

除直接寿命估计外，计算解混方法还结合了时间和光谱信息来分离部分重叠的荧光团信号。最近，深度学习策略通过同时分析光谱和寿命信息，进一步提升了多重标记性能，实现了高吞吐量的信号分离并提高了噪声容忍度，如图11(b)所示的基于相量图的U-Net所示。345,347–349相关的基于学习的方法可以直接从稀疏采样的时间门控测量中估计寿命参数，并纳入空间变化的IRF以改善非平面样本的重建。然而，其性能取决于训练和验证数据的代表性，特别是针对不同荧光团、光子水平和成像系统。

尽管这些分析方法能够实现越来越快速和灵活的寿命估计，但其可靠性仍然依赖于光子统计、仪器表征、模型假设以及用于评估不确定性的方法。这些局限性以及近红外FLI平台间标准化报告的需要将在下一节中讨论。

方法选择应遵循实验旨在恢复的量。对于快速映射表观寿命，稀疏时间门控采集结合快速寿命确定可以在单指数近似充分描述信号的情况下降低采集和处理需求。其适用性取决于时间门的放置、背景校正以及在可用光子预算内实现的精度。因此，性能应表达为在给定精度和空间分辨率下生成完整寿命图所需的时间，而非仅仅是探测器读出速度。快速的表观寿命估计不应被解释为解析出各个衰减组分。

衰减组分估计和FRET定量需要足够的时序信息和探测光子来约束所选模型。TCSPC、充分采样的时间门控测量和多频率频域采集可以提供互补方法，其性能由仪器响应表征、采样和参数可识别性决定。对于FRET，还需要匹配的供体单独参考和适当的对照来区分转移引起的缩短与其他光物理变化。比较应报告相关寿命和组分贡献的偏差和精度，以及光子计数、采集时间和施加的拟合约束。准确恢复平均寿命并不能建立多个组分寿命或FRET分数的等效准确性。

对于探针解混，当参考信号在测量条件下仍可区分时，相量和光谱-时间联合方法是有效的。其实用性能由串扰、已知信号贡献的恢复以及在强信号旁边检测弱组分的能力决定。相量分析避免了显式的多指数拟合，但分子分配仍然取决于合适的参考以及对仪器和 tissue 依赖的失真的控制。基于学习的方法同样需要在相关光子水平、探针混合物和仪器响应之间进行验证。当方法未在匹配条件下进行比较时，其报告的性能应在已演示的测量范围内进行解释。这种基于特定应用的评估为选择成像策略提供了比单独考虑的标称时间分辨率、像素数或帧率更有用的基础。新开发的平台pyFLI350通过统一的FLI数据分析、模拟和可视化界面解决了这一需求，标准化了跨采集系统的数据处理，并支持分析方法和基于深度学习的拟合。

6. 定量和可重复的近红外FLI面临的当前挑战

FLI已确立为一种稳健的定量成像方式，其在近红外领域的扩展在过去十年经历了快速增长，在分子成像、荧光引导手术、生物传感和临床前体内成像中的应用不断扩大。这一进展反映了人们对荧光寿命作为浓度无关且对环境敏感的对比来源日益增强的认可，特别是在生物环境中，基于强度的测量通常受到散射、吸收和荧光团浓度的干扰。然而，尽管发展势头强劲，近红外FLI的持续发展和更广泛采用仍受到若干基本科学和技术挑战的制约。

首要限制是缺乏针对近红外荧光团标准化且可重复的寿命数据。已报道的常用试剂（如ICG或IRDye 800CW）的寿命在不同缓冲液、结合状态和实验条件下有所变化，这对于对环境敏感的荧光团来说是预期的。然而，研究报告中的较大差异通常反映的是不完整的报告和不一致的寿命分析。这些不一致性阻碍了实验室间的比较并模糊了生理学解释。

当报告未完全指明激发和检测波长范围、探测器特性、检测信号和背景水平以及采集参数时，跨研究比较会进一步复杂化。激发和检测波段决定了哪些吸收和发射物种对测量的衰减有所贡献，而探测器响应和采集设置则决定了测量的时间分辨率和统计精度。14这些考虑对于亚纳秒近红外衰减尤为重要，因为有限的时间分辨率或不准确的IRF表征可能会使估计的寿命产生偏差，而相对于背景的低信号会降低测量精度。351可重复性评估还需要独立测量的数量以及重复测量中观察到的变异性。

在荧光团层面，能隙定律惩罚将近红外发射与增加的非辐射弛豫联系起来，导致许多近红外有机染料具有的特征性低量子产率和短荧光寿命。127这些性质对时间分辨采集提出了严格要求。当荧光衰减接近IRF的时间宽度时，IRF测量或对齐中的误差会直接使恢复的寿命产生偏差。由于IRF可能随检测波长、探测器通道和视场内位置而变化，应用单一全局IRF可能会引入波长或像素依赖的偏差，特别是对亚纳秒衰减而言。较长波长处探测器灵敏度的降低以及由组织吸收和散射引起的光子损失进一步减少了光子计数，增加了估计器方差，并限制了具有相似寿命的荧光团的可靠分离。205不一致的校准实践和作为寿命参考使用的荧光团的环境敏感性进一步复杂化了跨平台比较。

采集相关的伪影引入了额外的系统误差。在TCSPC测量中，当光子探测率相对于激发重复率过高时发生堆积效应。这种伪影优先记录激发循环早期到达的光子，从而缩短了恢复的寿命。探测器死时间、时间抖动、暗计数和背景光子进一步扭曲了测量的时间直方图。在时间门控系统中，门宽、门放置、时间步长和门间灵敏度变化决定了短衰减组分的采样精度。304,315,319,352在使用前沿阈值鉴别的探测器通道中，当具有不同幅度或上升沿的脉冲在不同时间穿越定时阈值时发生时间迁移，尽管它们对应于相同的光子到达时间。这种幅度依赖的电子延迟改变了探测器时间响应的位置和宽度，当IRF和荧光测量之间不同时会导致短荧光寿命估计产生偏差。353,354

生物异质性提出了一个独立分析挑战。当多个荧光团、结合状态、构象或AF来源对单个像素的信号有所贡献时，测量的衰减包含不能用单指数模型解析的多个寿命组分。多指数拟合通过估计多个衰减组分的寿命和分数贡献来表征这种复杂性。355然而，当组分数量增加、组分寿命重叠或探测光子计数不足时，估计变得病态。在这些条件下，恢复的参数强烈依赖于IRF、初始参数估计和拟合约束。356相量分析避免了显式的多指数拟合并保持了寿命组分之间的线性混合关系。然而，相量坐标不能唯一识别其潜在分子物种。定量分子分配因此需要参考相量或互补的光谱和生物学信息。光子计数噪声也会展宽相量分布并降低具有紧密间隔寿命特征的荧光团之间的分离度。346在宏观近红外FLI中，这些不确定性还会因散射组织中的光子传输而加剧。深度依赖的衰减和时间色散改变了测量的时间曲线，当分析未考虑组织光子传输时会使其恢复的寿命产生偏差。15大视场几何结构中的光子饥饿加剧了拟合不稳定性并放大了模型依赖的误差，特别是对亚纳秒衰减而言。357

可用近红外荧光团有限的寿命范围构成了多重标记的另一个障碍。本综述中讨论的几种常用有机近红外染料在引用研究中使用的特定溶剂、共轭和结合条件下，报告的荧光寿命约为0.3至2.0 ns。这一范围描述了这些测量结果，并不涵盖近红外探针类别的全部多样性。对于多重标记，应在代表预期应用的匹配条件下评估寿命分离度。

临床转化仍然受到类似限制，尽管寿命对比可能补充更广泛的临床应用成像。当前的转化努力在FGS中最为先进，大多数临床部署的系统依赖荧光强度来可视化ICG、5-ALA诱导的PpIX、MB或靶向近红外探针，而非测量荧光寿命。尽管寿命测量尚未纳入常规临床FGS，但初步临床研究已展示了其组织鉴别的潜力。ICG寿命已能在多种实体肿瘤类型中区分恶性与非癌组织，而PpIX寿命成像则已能区分脑肿瘤和浸润区域与非病理组织。30,31然而，这些研究代表的是早期临床验证而非寿命组织分类的标准化多中心验证。

总之，不一致的表征、采集依赖的误差、生物异质性、组织光子传输、有限的寿命分离度和有限的临床验证阻止了跨荧光团、成像平台和生物环境的寿命值直接比较。

7. 标准化和可转化的近红外FLI路径

解决上述障碍需要在测量标准化、荧光团表征、仪器和组织依赖效应的校正以及临床验证方面协调推进。

一个实际的第一步是一致的报告与每项寿命测量相关的实验和分析条件。为支持可重复性和跨研究比较，时间分辨近红外测量报告应记录溶剂或缓冲液组成、蛋白质结合状态、温度、激发和检测波长范围、探测器类型以及检测信号质量和背景水平。采集特定信息应包括脉冲测量的激发重复率、时间门控测量的门宽和时间采样，以及频域测量的调制频率。当进行独立重复测量时，报告的寿命应附带相应的标准偏差和测量次数。当IRF表征和对齐、预处理程序以及拟合标准包含在分析中时，也应进行描述。

除一致的报告外，系统校准还应包括具有独立表征寿命的参考荧光团，覆盖相关的测量范围。由于参考寿命可能随溶剂组成、温度、浓度和结合状态而变化，校准测量应在定义良好的条件下进行，并尽可能使用与样品相似的激发和检测设置。对于具有显著空间或波长依赖时间变化的成像系统，还应考虑通道或像素特定的IRF表征。

与此并行，一个汇编原始衰减曲线和元数据的策展开放获取数据库，在定义良好的实验条件下将大大促进探针筛选、多重标记成像模拟以及寿命预测和解混的机器学习模型训练。这种资源对于亚纳秒近红外荧光团尤为关键，因为有限的光子计数和与仪器响应函数的卷积使检测和参数估计本质上更具挑战性。

计算进步提供了更快和更稳健的寿命恢复的更广泛途径。已开发了用于无拟合寿命估计、压缩测量重建以及光子受限FLI数据分析的深度学习方法。347,357,358这些方法可以减少重建时间，并从传统拟合受限于稀疏光子计数的测量中恢复寿命信息。未来研究应评估其在不同荧光团、仪器、IRF、背景水平和生物标本之间的泛化能力。将数据驱动的重建与光子统计、仪器响应和组织光子传播的物理模型相结合，可能进一步减少模型依赖的误差并提高定量近红外FLI的可靠性。

未来近红外荧光团的开发应结合足够的亮度、化学稳定性、水性相容性和生物相容性，以及适合预期应用的寿命行为。

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