基于整合生物信息学分析鉴定膀胱癌中与G2/M检查点通路相关的免疫相关枢纽基因

《Cancer Informatics》：Identification of Immune-Associated Hub Genes Related to the G2/M Checkpoint Pathway in Bladder Cancer Through Integrated Bioinformatics Analysis

　　

膀胱癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，其特征是复杂的免疫相互作用，影响疾病进展和患者结局。因此，识别具有预后和治疗相关性的免疫相关分子决定因素至关重要。本研究旨在系统探究膀胱癌中参与免疫过程的免疫相关基因，并鉴定关键的预测性分子预后生物标志物，重点关注细胞周期相关的免疫机制。研究人员对来自五个独立队列（GSE13507、GSE19915、GSE40355、GSE42089和TCGA-膀胱癌）的膀胱肿瘤及相应正常组织的RNA表达谱进行了分析。利用GEO2R和TCGA分析鉴定共同的差异表达免疫相关基因（DEIRGs）。使用Metascape和DAVID进行功能富集和通路分析，并通过MCODE、CytoHubba和ClueGO基于蛋白质-蛋白质相互作用网络鉴定枢纽基因。使用UALCAN、Human Protein Atlas、TIMER2.0和PrognoScan数据库验证表达模式、预后相关性和免疫关联。结果：共鉴定出300个共同的DEIRGs。网络分析揭示了21个显著的免疫相关枢纽基因，其中多个基因持续富集于G2M检查点通路。11个枢纽基因与膀胱癌患者总生存期降低显著相关。值得注意的是，六个G2M检查点相关基因（TOP2A、CCNA2、CDK1、BIRC5、PLK1和E2F1）在多个队列中显示出强烈的预后相关性。结论：这项综合性计算机模拟分析强调了G2M检查点相关免疫基因在膀胱癌进展中的关键作用。这些基因代表了预测性分子预后免疫生物标志物和潜在治疗靶点，为膀胱癌个性化免疫治疗策略的开发奠定了基础。

基于整合生物信息学分析鉴定膀胱癌中与G2/M检查点通路相关的免疫相关枢纽基因

1. 研究背景与问题

膀胱癌（Bladder carcinoma, Blca）是全球第10大常见恶性肿瘤，2020年新发病例约573,278例，死亡病例212,536例，在癌症相关死亡率中居第13位。膀胱癌在组织学上以尿路上皮癌（urothelial carcinoma, BUC）为主，约占90%，进一步分为肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer, MIBC）和非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer, NMIBC）。NMIBC约占新发病例的70%，复发率高达60%，约10%进展为MIBC；MIBC约占30%，因侵袭性和转移潜能而预后较差。尽管有经尿道切除术、化疗、放疗和根治性膀胱切除术等治疗方法，五年生存率仍基本未改善，且膀胱癌治疗费用高昂，高复发率需要频繁监测，亟需创新治疗策略。

肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的免疫细胞、基质成分、细胞外囊泡和细胞因子在肿瘤进展、基因调控和治疗反应中发挥关键作用。TME内功能失调的免疫应答促进肿瘤发生、复发和转移。免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）如PD-1、PD-L1和CTLA-4已在包括膀胱癌在内的多种恶性肿瘤中显示出前景，但临床疗效在不同癌症类型间差异显著（如黑色素瘤反应率30–45%，头颈癌仅13%）。部分癌症反应有限部分归因于调节性T细胞介导的免疫抑制，而PD-1/PD-L1阻断可能反常地促进调节性T细胞活性，导致治疗耐药。因此，深入理解膀胱癌的免疫逃逸机制并识别预测性生物标志物以改善治疗结局至关重要。

近年来，转录组学和分子谱分析研究揭示了BUC亚型的关键免疫模式。整合免疫特征与多组学数据有助于更精确地对膀胱癌进行分类，但将免疫生物标志物发现转化为临床应用仍面临挑战。为此，研究人员开展了这项综合性计算机模拟（in silico）分析，旨在系统鉴定膀胱癌中的免疫相关枢纽基因，并评估其预后价值和免疫关联。

2. 研究内容与结论

研究人员利用五个公共转录组数据集：GSE13507（韩国）、GSE19915（瑞典）、GSE40355（德国）、GSE42089（美国）和TCGA-BLCA（全球数据集，404例肿瘤和19例正常样本），通过差异表达分析、免疫相关基因交集筛选、功能富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络构建等方法，鉴定了膀胱癌中的差异表达免疫相关基因（differentially expressed immune-related genes, DEIRGs）及其关键枢纽基因。通过多数据库验证，发现11个免疫相关基因（ANLN、BIRC5、BUB1B、CAV1、CCNA2、CD69、CDK1、E2F1、IL1A、PLK1和TOP2A）与膀胱癌患者总生存期（overall survival, OS）显著相关，其中核心六个G2M检查点相关基因（TOP2A、CCNA2、CDK1、BIRC5、PLK1和E2F1）在多个地理和技术异质队列中均表现出稳健的预后价值。在GSE32894队列的多因素Cox回归分析中，分子亚型是唯一与生存独立相关的因素（HR=1.95；95%CI 1.20–3.17；P=0.007）。该研究强调了G2M检查点相关免疫基因在膀胱癌进展中的关键作用，为开发个性化免疫治疗策略提供了理论基础。

3. 关键技术与方法

研究样本队列来源包括GSE13507（韩国，首尔国立大学盆唐医院）、GSE19915（瑞典）、GSE40355（德国）、GSE42089（美国）及TCGA-BLCA（全球多中心）。主要技术方法包括：（1）使用GEO2R（基于R的limma包）和GEPIA2平台进行差异表达基因（DEGs）筛选，阈值设为|log2FC|≥1且调整后p<0.05；（2）从ImmPort、InnateDB、IRIS和Immunome数据库获取5,533个已知免疫相关基因（IRGs），与DEGs取交集获得DEIRGs；（3）使用Metascape和DAVID进行GO和KEGG通路富集分析；（4）利用STRING v12构建PPI网络，通过Cytoscape中的MCODE和CytoHubba（五种拓扑算法：closeness、degree、EPC、MCC、MNC）识别枢纽基因；（5）使用UALCAN和Human Protein Atlas（HPA）验证mRNA和蛋白表达水平；（6）使用TIMER2.0评估枢纽基因表达与免疫细胞浸润的相关性；（7）使用PrognoScan进行Cox比例风险回归生存分析；（8）在GSE32894队列（224例尿路上皮癌患者）中进行多因素Cox回归分析。

4. 研究结果

4.1 膀胱癌差异表达基因的鉴定

研究人员从五个数据集中分别鉴定出差异表达基因：TCGA-BLCA共2,969个（944个上调，2,025个下调）、GSE42089共923个（392个上调，531个下调）、GSE40355共2,676个（944个上调，1,732个下调）、GSE13507共1,066个（290个上调，776个下调）、GSE19915共1,302个（732个上调，570个下调）。通过Venn图取至少在三个数据集中重叠的DEGs，共获得756个共同DEGs。将这些DEGs与免疫相关基因取交集，最终获得300个DEIRGs。

4.2 DEIRGs的功能富集分析

Metascape富集分析显示，DEIRGs显著富集于10个Hallmark基因集（包括上皮间质转化、TNFα/NF-κB信号、G2M检查点、肌生成、IL2/STAT5信号、UV应答下调、干扰素γ应答、KRAS信号上调、炎症反应和缺氧）和10条KEGG通路（包括轴突导向、催产素信号通路、黏着斑、癌症通路、AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、补体和凝血级联、人T细胞白血病病毒1型感染、细胞周期和白细胞跨内皮迁移）。DAVID GO分析显示，DEIRGs主要参与RNA聚合酶II启动子转录的正向调控、细胞黏附、信号转导、凋亡过程负调控等生物学过程；细胞组分方面主要定位于质膜、胞质溶胶、细胞质、细胞外区域等；分子功能方面主要涉及蛋白质结合、相同蛋白质结合、钙离子结合、蛋白质同源二聚化活性等。

4.3 PPI网络与模块分析

将300个DEIRGs导入STRING数据库构建PPI网络，在Cytoscape中可视化得到300个节点和1,856条边（PPI富集p<1.0e-16）。通过MCODE鉴定出两个显著模块：模块1（MCODE得分20.857，22个节点，438条边）主要富集于细胞周期（BUB1、BUB1B、CCNA2、CCNB2、CDK1、E2F1、ESPL1、PLK1）、染色体浓缩（AURKB、BUB1B、CCNA2、CDK1、NUSAP1、PLK1、TOP2A）和有丝分裂胞质分裂（ANLN、AURKB、BIRC5、BUB1、BUB1B、CCNB2、CDK1、ESPL1、NUSAP1、PLK1、RACGAP1、TOP2A）；模块2（MCODE得分8.353，18个节点，142条边）主要富集于AGE-RAGE信号通路、颅骨骨骼系统发育、肾小球发育和缺血应答。

4.4 枢纽基因鉴定与GSEA分析

通过CytoHubba五种拓扑算法（Closeness、Degree、EPC、MCC、MNC）分别取前50个基因，Venn图交集后与MCODE模块基因映射，共获得21个显著枢纽基因：TGFBR2、ANXA5、CSF3、PLK1、CDK1、TGFB3、EGR1、TOP2A、IL1A、PDGFRA、TIMP2、DCN、BUB1B、CAV1、BCL2、CD163、E2F1、CCNA2、CD69、ANLN和BIRC5。GSEA分析显示，G2M检查点基因集在所有数据集中均显著富集，此外在GSE13507、GSE40355和GSE42089中还富集了有丝分裂纺锤体和E2F靶点基因集。

4.5 枢纽基因表达的验证

UALCAN分析显示，在TCGA-BLCA数据集中，CCNA2、E2F1、BIRC5、CDK1、IL1A、TOP2A、BUB1B和PLK1的mRNA表达显著上调，而EGR1、TGFBR2、TIMP2、BCL2、CD69、PDGFRA、CAV1、DCN和TGFB3显著下调。CD163、ANXA5、CSF3表达下调，ANLN表达升高（但未达显著性）。HPA免疫组化数据显示，CDK1、TOP2A、BIRC5、CAV1、PLK1、DCN和ANLN在膀胱癌组织中的蛋白水平较正常组织增强；E2F1、CD69、EGR1、TIMP2、CCNA2、PLK1、EGR1的蛋白表达无显著差异。

4.6 枢纽基因表达与免疫细胞浸润的相关性

TIMER分析表明，21个枢纽基因表达均与中性粒细胞浸润呈正相关；除PDGFRA外的20个基因与CD8+ T细胞浸润显著正相关；18个基因与树突状细胞浸润正相关；ANXA5、TGFB3、EGR1、PDGFRA、TIMP2、CAV1和ANLN与B细胞浸润负相关；TGFB3、PDGFRA、DCN和CD69与CD4+ T细胞浸润正相关，而PLK1、CDK1、TOP2A、BUB1B、CCNA2、ANLN和BIRC5与CD4+ T细胞浸润负相关。结果表明这些枢纽基因可能在调节TME中发挥关键作用。

4.7 枢纽基因的生存分析

PrognoScan生存分析显示，21个枢纽基因中有11个（ANLN、BIRC5、BUB1B、CAV1、CCNA2、CD69、CDK1、E2F1、IL1A、PLK1和TOP2A）与膀胱癌患者总生存期显著相关。在GSE5287队列中，BIRC5、CAV1、CCNA2、CDK1、IL1A、PLK1和TOP2A高表达与生存期缩短显著相关；在GSE13507队列中，BIRC5、BUB1B、CCNA2、CD69和TOP2A高表达与较差生存相关，而ANLN和CDK1低表达与较差生存相关。

4.8 多因素Cox回归分析

在GSE32894队列的224例尿路上皮癌患者中，多因素Cox回归分析显示，分子亚型是唯一与生存独立相关的变量（HR=1.95；95%CI 1.20–3.17；P=0.007）。CCNA2高表达显示出改善生存的趋势（HR=0.33；95%CI 0.11–1.04；P=0.059），接近统计学显著性。BIRC5（HR=2.11；P=0.12）、TOP2A（HR=1.96；P=0.3）和肿瘤分级（HR=1.94；P=0.2）的风险比升高但未达统计学显著性。

5. 讨论与结论

讨论部分指出，DEIRGs富集的通路（EMT、TNFα/NF-κB、G2M检查点等）在膀胱癌进展中发挥关键作用。11个预后相关枢纽基因中，BIRC5、CAV1、CCNA2、CDK1、CD69、E2F1、IL1A、PLK1、TOP2A等基因通过调控细胞周期、免疫细胞浸润、免疫抑制微环境形成等机制影响膀胱癌进展和患者生存。值得注意的是，转录组与蛋白质组水平的部分差异（如CCNA2、E2F1、PLK1 mRNA上调但蛋白水平无显著差异）可归因于转录后调控和蛋白酶体降解。多因素分析中分子亚型的独立预后价值与既往膀胱癌分子分型研究一致。

研究结论为：通过整合多队列生物信息学方法，研究人员鉴定并验证了11个与膀胱尿路上皮癌（BLCA）患者总生存期显著相关的免疫相关风险基因（ANLN、BIRC5、BUB1B、CAV1、CCNA2、CD69、CDK1、E2F1、IL1A、PLK1和TOP2A）。其中核心六个基因子集（TOP2A、CCNA2、CDK1、BIRC5、PLK1和E2F1）主要富集于G2/M细胞周期检查点通路，在多个不同地理区域和技术平台中显示出稳健且独立的预后价值。这些基因代表了候选的预测性分子预后生物标志物，以及细胞周期定向和精准免疫治疗策略的潜在靶点。未来需要通过独立前瞻性队列、功能获得/缺失实验及前瞻性临床研究进一步验证这些生物信息学发现向临床应用的转化价值。