FOXG1通过NANOG介导的细胞干性增强前列腺癌紫杉醇耐药性

《American Journal of Men's Health》：FOXG1 Enhances Paclitaxel Resistance in Prostate Cancer via NANOG-Mediated Cellular Stemness

　　

摘要专业翻译 背景：紫杉醇（PTX）是前列腺癌（PCa）有效的化疗药物，但随着疾病进展会出现耐药性。癌细胞干性与PTX耐药密切相关。本研究旨在阐明FOXG1是否通过细胞干性调控PCa的PTX耐药。 方法：研究人员从TCGA数据库查询FOXG1在PCa中的表达情况。通过逐步递增PTX浓度构建PTX耐药PCa细胞系。采用qRT-PCR定量检测PCa细胞中FOXG1和NANOG的表达水平。CCK-8实验、成球实验和流式细胞术分别评估细胞活力、干性和凋亡。蛋白质印迹法（Western blot）检测凋亡相关蛋白。JASPAR数据库预测FOXG1在NANOG中的结合位点。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀（ChIP）验证FOXG1–NANOG相互作用。 结果：生物信息学分析显示FOXG1在PCa组织中表达升高。FOXG1水平在PCa细胞中同样升高。研究人员成功建立了PTX耐药PC-3亚系（PC-3-R）。沉默FOXG1抑制了PTX暴露下PC-3-R细胞的干性和活力，同时促进凋亡。FOXG1被鉴定为NANOG的上游调控因子。NANOG过表达逆转了FOXG1沉默对PC-3-R细胞产生的影响。 结论：FOXG1通过促进NANOG介导的细胞干性来增强PCa的PTX耐药性。

论文解读

一、研究背景与科学问题

前列腺癌（PCa）是全球男性第二大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一，每年新发病例约160万例，死亡约36.6万例。目前PCa的主要治疗手段包括手术、化疗、放疗和激素治疗。由于PCa常发生转移，以多西他赛、紫杉醇（PTX）和顺铂为代表的化疗药物是转移性疾病的优选方案。PTX是一种从短叶红豆杉树皮和针叶中提取的天然三环二萜类化合物，主要通过结合微管蛋白并稳定微管结构发挥抗肿瘤活性。然而，随着疾病进展，PCa细胞常产生PTX耐药，导致肿瘤复发和转移，显著降低患者生存率。因此，深入阐明PTX耐药的分子机制，对提高PCa化疗疗效具有重要的临床意义。

FOXG1属于叉头框（winged-helix forkhead）转录因子家族，在大脑发育过程中高表达，主要通过DNA结合调控下游靶基因转录。近年来，FOXG1在多种肿瘤中的作用日益受到关注。FOXG1可通过调控自噬降低胶质瘤细胞放射敏感性；可驱动皮肤鳞状细胞癌的恶性进展；还可增强非小细胞肺癌（NSCLC）的顺铂耐药性。值得注意的是，已有研究报道FOXG1在PCa中高表达，并通过上调氧化磷酸化通路促进多西他赛耐药，而柴胡皂苷-d可逆转该耐药效应。鉴于FOXG1已参与多种肿瘤的治疗耐药，且其在PCa多西他赛耐药中的调控作用已初步证实，FOXG1是否参与PCa的PTX耐药调控值得深入探究。

癌细胞干性是肿瘤进展的关键驱动因素，通过赋予恶性细胞自我更新和分化能力，促进PTX耐药。FOXG1可促进骨髓间充质干细胞成骨分化，其上调可增强神经干细胞自我更新能力。然而，FOXG1是否通过影响PCa细胞干性来促进PTX耐药尚不明确。NANOG是一种同源盒（homeodomain）转录因子，可维持干样癌细胞的长期增殖潜能、转移能力和治疗耐药性。NANOG介导的细胞干性对卵巢癌PTX耐药至关重要；在PTX耐药的PCa细胞中，NANOG表达升高并伴随干性获得。因此，能够调控细胞干性的NANOG可能与PCa的PTX耐药相关，但FOXG1与NANOG在PCa中的调控关系此前尚未明确。

基于上述背景，本研究旨在深入探讨FOXG1赋予PCa细胞PTX耐药的分子机制，为改善PCa患者的临床疗效和预后提供理论依据和分子靶点。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员从TCGA数据库（正常样本52例，肿瘤样本501例）获取PCa转录组数据，利用edgeR包进行差异表达分析，并以箱线图展示FOXG1表达水平。通过JASPAR数据库预测FOXG1结合基序，从Ensembl下载NANOG基因5′侧翼序列，预测FOXG1–NANOG相互作用位点。研究人员采用逐步递增PTX浓度的方法建立PTX耐药PC-3亚系（PC-3-R）和DU145-R细胞系。主要实验技术包括：qRT-PCR定量检测FOXG1和NANOG mRNA水平；CCK-8实验评估细胞活力并计算半数抑制浓度（IC₅₀）；成球实验评估细胞干性；流式细胞术检测细胞凋亡及CD44⁺CD133⁺双阳性干样细胞亚群比例；蛋白质印迹法（Western blot）检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达；双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀（ChIP）验证FOXG1与NANOG启动子的直接结合。

三、研究结果

3.1 FOXG1在PTX耐药PCa细胞中上调

TCGA数据库分析显示，FOXG1在PCa组织中的表达显著升高。qRT-PCR和Western blot验证结果显示，FOXG1在DU145、PC-3和22Rv1三种PCa细胞系中的表达均高于正常前列腺上皮细胞RWPE-1，其中PC-3细胞中表达水平最高。研究人员成功建立PTX耐药亚系PC-3-R后，PTX的IC₅₀值从亲本PC-3细胞的8.157 nM升至PC-3-R细胞的87.12 nM。在无PTX条件下，PC-3-R细胞增殖速度快于亲本PC-3细胞。形态学观察显示，PC-3细胞呈纺锤形间充质样形态，而PC-3-R细胞呈鳞状或上皮样形态。与PC-3细胞相比，PC-3-R细胞中FOXG1表达进一步升高。这些数据提示FOXG1上调与PCa细胞PTX耐药表型之间存在潜在关联。

3.2 FOXG1在体外促进PCa细胞PTX耐药

研究人员在PC-3-R和DU145-R两种PTX耐药细胞系中分别沉默FOXG1。结果显示，FOXG1沉默显著降低了两种细胞系的PTX IC₅₀值。在DMSO或PTX处理条件下，FOXG1沉默均抑制细胞活力并诱导凋亡。流式细胞术分析显示，单独FOXG1沉默或单独PTX处理均可减少CD44⁺CD133⁺双阳性干样细胞亚群比例，而联合处理产生更显著的抑制效果。此外，与亲本细胞相比，两种耐药细胞系均表现出显著增强的干性特征，而FOXG1沉默有效逆转了该表型。两种PTX耐药细胞系的一致结果表明，FOXG1在PCa的PTX耐药中发挥促进作用。

3.3 FOXG1是NANOG的上游调控因子

研究人员进一步寻找FOXG1的下游靶点。NANOG是维持癌细胞干性的关键因子。JASPAR预测显示NANOG启动子内存在推定的FOXG1结合位点。双荧光素酶报告基因实验和ChIP实验证实FOXG1可直接结合NANOG启动子。补充的Western blot结果显示，FOXG1抗体免疫沉淀组中FOXG1蛋白富集高于IgG对照组，进一步验证了免疫沉淀的特异性。因此，FOXG1在PCa中作为NANOG的上游调控因子发挥作用。

3.4 FOXG1–NANOG轴通过增强干性促进PCa细胞PTX耐药

为确定FOXG1是否通过NANOG驱动PTX耐药，研究人员在PC-3-R细胞中过表达NANOG。FOXG1沉默降低了NANOG表达，而NANOG过表达恢复了NANOG水平。CCK-8实验显示，NANOG过表达挽救了FOXG1敲低在PTX处理下造成的细胞活力下降。一致地，NANOG过表达减弱了FOXG1沉默在PTX处理的PC-3-R细胞中的促凋亡效应。流式细胞术检测CD44⁺CD133⁺双阳性细胞比例显示，FOXG1敲低显著减少该干样细胞亚群，而NANOG过表达逆转了这一抑制效应，将双阳性细胞比例恢复至接近对照组水平。成球实验进一步揭示，NANOG过表达逆转了FOXG1缺失导致的干性降低。综上，FOXG1–NANOG轴通过增强细胞干性促进PCa细胞的PTX耐药。

四、讨论与结论总结

PTX耐药是PCa治疗中常见的临床障碍，可导致肿瘤复发和转移，显著降低患者生存率，但其分子基础仍不清楚。本研究基于生物信息学分析和体外功能实验，提出FOXG1可能通过NANOG介导的癌细胞干性促进PCa的PTX耐药这一潜在调控轴。

FOXG1在多种肿瘤中上调并参与肿瘤进展。FOXG1可促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并通过改善线粒体功能加速疾病进展；FOXG1表达增加可驱动胶质母细胞瘤干细胞从静止期向增殖期转变，加速癌症进展。在化疗耐药方面，衡州乌药碱可通过破坏FOXG1与EFHD2启动子的结合恢复NSCLC的顺铂敏感性；柴胡皂苷-d可通过靶向抑制FOXG1介导的氧化磷酸化减弱PCa的多西他赛耐药。本研究首次建立PTX耐药PCa细胞系（PC-3-R），观察到与亲本PC-3细胞相比，PC-3-R细胞中FOXG1表达进一步升高。在PC-3-R细胞中沉默FOXG1可降低其在PTX处理下的干性和活力，并增强PTX暴露后的凋亡。综上，FOXG1促进PCa的PTX耐药。

NANOG作为细胞干性标志物，其上调影响癌症进展并在化疗耐药中发挥重要作用。磷酸化c-Fos通过增加NANOG介导的癌细胞干性增强结肠癌的5-氟尿嘧啶耐药性；SOX9和HMGB3协同激活NANOG促进PCa进展；NF-κB通过上调NANOG增强PCa细胞干性。然而，NANOG介导PCa PTX耐药的分子机制尚未完全阐明。本研究通过JASPAR预测NANOG启动子内的FOXG1结合位点，双荧光素酶报告基因和ChIP实验证实FOXG1是NANOG的上游调控因子。在PC-3-R细胞中沉默FOXG1并同时过表达NANOG后，NANOG过表达逆转了FOXG1沉默对PC-3-R细胞活力、干性和凋亡的影响。研究人员提出，FOXG1通过促进NANOG介导的细胞干性驱动PCa的PTX耐药。

与既往研究相比，本研究的发现具有机制互补性。Meng等人（2024）虽同样证实FOXG1在PCa中高表达，但其研究聚焦于FOXG1介导的氧化磷酸化通路在多西他赛耐药中的作用；而本研究揭示FOXG1通过转录上调NANOG增强细胞干性，从而介导PTX耐药，扩展了FOXG1介导化疗耐药的作用网络。此外，Che等人（2022）虽同样建立了PTX耐药PC-3细胞模型，但其研究主要关注TLR-4信号通路的贡献；相比之下，本研究深入阐明了FOXG1与NANOG之间的调控轴，为理解PCa耐药机制提供了新视角。

本研究存在一定局限性。仅在体外水平探讨了FOXG1促进PCa PTX耐药的分子机制，尚需体内和临床实验验证FOXG1在PCa PTX耐药中的功能。此外，NANOG调控的下游靶基因未在本研究中涉及，后续研究将鉴定NANOG靶基因以完善FOXG1调控PCa PTX耐药的分子调控网络。本研究未对DU145-R细胞与亲本DU145细胞进行形态学差异比较分析。方法学上，本研究所用NANOG引物的扩增产物相对较长且未跨越外显子连接区，可能影响扩增效率，建议后续研究采用跨越外显子连接的较短引物以提高定量可靠性。

研究结论：FOXG1通过促进NANOG介导的细胞干性增强PCa的PTX耐药性。FOXG1–NANOG轴驱动细胞干性进而促进PTX耐药。该发现为克服PTX耐药带来的临床挑战提供了新见解。