《Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids》：Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles promote macrophage efferocytosis and inflammation resolution in osteoarthritis through the miR-21a-5p/YAP1 axis
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目的：骨关节炎是一种涉及慢性炎症和软骨退变的疾病。受损的巨噬细胞胞葬作用可能促进骨关节炎进展。本研究探讨了间充质干细胞来源细胞外囊泡是否能够增强骨关节炎中的巨噬细胞胞葬作用和炎症消退。
方法：研究人员利用单细胞RNA测序数据分析了人骨关节炎相关巨噬细胞群体。采
目的：骨关节炎是一种涉及慢性炎症和软骨退变的疾病。受损的巨噬细胞胞葬作用可能促进骨关节炎进展。本研究探讨了间充质干细胞来源细胞外囊泡是否能够增强骨关节炎中的巨噬细胞胞葬作用和炎症消退。
方法：研究人员利用单细胞RNA测序数据分析了人骨关节炎相关巨噬细胞群体。采用骨髓来源巨噬细胞与凋亡软骨细胞共培养的体外模型评估胞葬作用和炎症反应。通过微小RNA谱分析、荧光素酶报告实验和功能实验研究miR-21a-5p/YAP1通路。利用小鼠内侧半月板失稳模型评估治疗效果。
结果：对单细胞转录组数据集的再分析显示，骨关节炎样本中促炎巨噬细胞群体比例增加，胞葬作用相关特征减少。间充质干细胞来源细胞外囊泡增强了巨噬细胞胞葬作用，促进了促消退炎症表型，并在体外减轻了软骨细胞损伤。miR-21a-5p被鉴定为间充质干细胞来源细胞外囊泡中高度富集的微小RNA，且在骨关节炎人样本中降低。间充质干细胞来源细胞外囊泡处理增加了巨噬细胞中miR-21a-5p丰度，而miR-21a-5p直接靶向Yap1 3'非翻译区并调节胞葬作用相关基因表达，包括Gas6、Mertk和Stab2。YAP1过表达抵消了这些效应。在内侧半月板失稳模型中，间充质干细胞来源细胞外囊泡处理和关节腔内注射miR-21a-5p模拟物减少了骨赘形成，保留了软骨结构，降低了OARSI评分和滑膜炎评分，并改善了炎症和胞葬作用相关分子谱。总之，这些发现支持miR-21a-5p/YAP1轴对间充质干细胞来源细胞外囊泡相关的巨噬细胞调节和骨关节炎保护的功能贡献。
结论：间充质干细胞来源细胞外囊泡通过miR-21a-5p/YAP1通路促进骨关节炎中巨噬细胞胞葬作用和关节保护，为炎症消退提供了潜在的治疗策略。
研究背景
骨关节炎是全球范围内导致慢性关节疼痛和功能障碍的主要原因，其特征为进行性软骨退变、滑膜炎症和软骨下骨重塑。尽管疾病负担沉重，现有治疗主要针对症状管理而非改变疾病基本进程。越来越多的证据表明免疫失调，特别是巨噬细胞驱动的炎症，是骨关节炎发病机制的重要促成因素。滑膜微环境中的巨噬细胞表现出显著的表型可塑性，可呈现促炎或抗炎状态，这对组织稳态和修复至关重要。胞葬作用是巨噬细胞清除凋亡细胞的过程，在炎症消退中发挥关键作用。该过程受损可能促使凋亡软骨细胞持续存在、继发性坏死和持续的炎症信号传导，从而促进骨关节炎进展。骨髓间充质干细胞因其免疫调节和营养特性在再生医学中引起广泛兴趣。越来越多的证据表明其治疗效应主要由旁分泌信号介导，其中细胞外囊泡在此机制中发挥关键作用。然而，骨髓间充质干细胞来源细胞外囊泡在骨关节炎中调控巨噬细胞胞葬作用的作用及潜在分子机制仍不完全清楚。微小RNA是骨关节炎发病机制的重要调节因子，影响软骨细胞代谢、滑膜纤维化和炎症反应。尽管已知间充质干细胞可通过细胞外囊泡携带生物活性分子包括微小RNA参与细胞间通讯，但骨髓间充质干细胞是否通过细胞外囊泡相关信号调控巨噬细胞胞葬作用、涉及哪些微小RNA以及这些通路如何在骨关节炎微环境中运作尚不清楚。因此，研究人员结合单细胞转录组分析与功能性体外实验和体内验证来回答这些问题。
主要关键技术方法
- 1.
单细胞RNA测序数据分析：从GEO数据库获取人膝关节单细胞RNA测序数据集GSE220243，包含健康及骨关节炎软骨和半月板组织共26个文库，通过质量控制、降维聚类和Harmony整合分析鉴定细胞群体。
- 2.
体外共培养模型：建立骨髓来源巨噬细胞与凋亡软骨细胞的共培养体系，通过免疫荧光显微镜评估胞葬指数，并通过实时定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹检测基因及蛋白表达变化。
- 3.
微小RNA测序与功能实验：对纯化的间充质干细胞来源细胞外囊泡进行小RNA测序筛选高丰度微小RNA，通过瞬时转染实现巨噬细胞中miR-21a-5p的过表达或抑制，利用双荧光素酶报告实验验证miR-21a-5p与Yap1 3'非翻译区的靶向关系。
- 4.
动物模型：采用C57BL/6小鼠内侧半月板失稳手术诱导骨关节炎模型，通过关节腔内注射进行干预，利用显微计算机断层扫描和组织学染色评估骨赘体积、OARSI评分和滑膜炎评分等指标。
研究结果
骨关节炎与炎症性巨噬细胞状态和受损的胞葬作用相关
研究人员重新分析了公开的单细胞转录组数据集GSE220243，将来自对照和骨关节炎样本的细胞分为14个主要细胞群体。无偏聚类识别出七个具有不同转录谱的巨噬细胞亚群。伪时间轨迹分析显示Mac0细胞主要位于推断轨迹起始端，而高表达炎症基因的Mac4细胞富集于末端区域。基因特征评分显示Mac0具有更强的M2样转录特征，Mac4则具有更明显的M1样特征。人骨关节炎滑膜组织显示显著的滑膜增生和细胞浸润，CD68阳性巨噬细胞和iNOS阳性细胞比例升高，而TREM2阳性巨噬细胞比例显著降低。体外实验表明，与凋亡软骨细胞共培养使巨噬细胞呈现促消退表型，而阻断胞葬作用则促进炎症激活。
骨髓间充质干细胞通过细胞外囊泡介导机制增强巨噬细胞胞葬作用和炎症消退
研究人员从小鼠骨髓中分离并鉴定了骨髓间充质干细胞。脂多糖刺激降低了巨噬细胞中胞葬作用相关基因的表达，而与骨髓间充质干细胞共培养可缓解这些效应。GW4869处理减弱了骨髓间充质干细胞对胞葬作用相关基因表达的影响。纯化的间充质干细胞来源细胞外囊泡经透射电镜、蛋白免疫印迹和纳米颗粒追踪分析鉴定后，展现出与骨髓间充质干细胞相似的效果，恢复了胞葬作用相关基因表达，增强了巨噬细胞对荧光标记凋亡细胞的清除能力，并促进了促消退炎症表型。
间充质干细胞来源细胞外囊泡诱导的巨噬细胞胞葬作用增强减轻了体外软骨细胞损伤
与胞葬作用受损的巨噬细胞共培养的软骨细胞表现出合成代谢基因Sox9和Col2a1表达降低，分解代谢基因Mmp3和Mmp13表达升高。间充质干细胞来源细胞外囊泡处理有效逆转了这些变化，降低了软骨细胞凋亡率。在间接共培养模型中，胞葬作用增强的巨噬细胞显著改善了凋亡软骨细胞的凋亡和分解代谢反应。
骨髓间充质干细胞通过细胞外囊泡相关的旁分泌信号在体内增强巨噬细胞胞葬作用、减轻炎症和软骨细胞损伤
在内侧半月板失稳小鼠模型中，骨髓间充质干细胞给药显著减轻了骨赘形成和异位钙化，保留了软骨结构，降低了OARSI评分、骨赘评分和滑膜炎评分。GW4869预处理减弱了这些结构性改善效果。免疫荧光染色显示骨髓间充质干细胞降低了滑膜中iNOS表达和软骨细胞凋亡，恢复了Aggrecan水平并降低了Mmp3表达。滑膜组织基因表达分析表明骨髓间充质干细胞部分恢复了胞葬作用相关基因和炎症基因的表达，而这些效应被GW4869预处理减弱。
miR-21a-5p在骨髓间充质干细胞来源细胞外囊泡中丰富且与骨关节炎相关的巨噬细胞变化有关
微小RNA测序分析鉴定出miR-21a-5p为骨髓间充质干细胞来源细胞外囊泡中最丰富的微小RNA之一。间充质干细胞来源细胞外囊泡处理后巨噬细胞中miR-21a-5p水平升高，而脂多糖单独刺激未产生此效应。骨关节炎患者滑液来源细胞外囊泡和滑膜组织中miR-21a-5p显著下调。与骨髓间充质干细胞共培养增加了巨噬细胞中miR-21a-5p丰度，而GW4869预处理减弱了这一增加。体内实验中，局部给予GW4869显著降低了小鼠滑膜组织中miR-21a-5p水平，原位杂交显示其在软骨下骨髓腔中显著表达且在骨关节炎小鼠中减少。
间充质干细胞来源细胞外囊泡通过miR-21a-5p/YAP1轴恢复巨噬细胞胞葬作用和抗炎表型
批量RNA测序结合KEGG通路富集分析显示间充质干细胞来源细胞外囊泡显著调节了胞葬作用和炎症相关通路。当产生细胞外囊泡的骨髓间充质干细胞转染miR-21a-5p抑制剂时，巨噬细胞对间充质干细胞来源细胞外囊泡的反应减弱。生物信息学预测和双荧光素酶报告实验证实miR-21a-5p直接靶向Yap1 3'非翻译区。YAP1过表达抵消了间充质干细胞来源细胞外囊泡对胞葬作用相关基因和炎症基因的调节效应，而Yap1敲低则模拟了miR-21a-5p过表达的效果。
讨论与结论
本研究的发现揭示了骨关节炎中巨噬细胞胞葬作用受损与增强的炎症反应和组织损伤之间的关联。研究人员鉴定出miR-21a-5p是间充质干细胞来源细胞外囊泡中普遍存在的微小RNA，并阐明了其在调控巨噬细胞胞葬作用中的作用。YAP1被确定为miR-21a-5p的下游靶点。研究结果表明，细胞外囊泡相关的miR-21a-5p/YAP1信号在调节巨噬细胞功能中发挥作用。综合来看，这些发现支持miR-21a-5p/YAP1通路对间充质干细胞来源细胞外囊泡相关的巨噬细胞调节和骨关节炎保护的功能贡献。
研究结论：间充质干细胞来源细胞外囊泡通过miR-21a-5p/YAP1通路促进骨关节炎中巨噬细胞胞葬作用和关节保护，为炎症消退提供了潜在的治疗策略。
