黄芪-葛根配伍通过PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬改善T2DM大鼠胰岛素抵抗的机制研究

《Pharmacognosy Magazine》：Mechanism of Astragali Radix–Puerariae Lobatae Radix Compatibility Regulating Mitochondrial Autophagy through the PINK1/Parkin Pathway to Improve Insulin Resistance in T2DM Rats

　　

背景：2型糖尿病伴胰岛素抵抗（T2DM IR）与线粒体功能障碍及肝组织异位脂质蓄积密切相关。目的：探讨黄芪-葛根配伍（GQ）通过PINK1/Parkin信号通路对T2DM IR大鼠肝细胞线粒体自噬的治疗作用及潜在机制。材料与方法：采用雄性Sprague-Dawley大鼠，经高脂饮食喂养并注射链脲佐菌素（STZ）诱导T2DM IR模型，随后以GQ、CCCP（线粒体自噬诱导剂）或3-MA（自噬抑制剂）治疗4周。评估糖脂参数、氧化应激标志物、肝脏组织学和线粒体超微结构。采用Western blot检测LC3-II/I（微管相关蛋白1轻链3-II/I）、PINK1（PTEN诱导激酶1）、Parkin（E3泛素连接酶）、TOM20（线粒体外膜转位酶20）、TIM23（线粒体内膜转位酶23）和P62（自噬选择性底物蛋白）表达。结果：T2DM IR模型大鼠表现出明显胰岛素抵抗、脂代谢紊乱、活性氧（ROS）/丙二醛（MDA）水平升高、线粒体超微结构损伤及自噬流受损。GQ治疗显著降低空腹血糖（FBG）、稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、游离脂肪酸（FFA）、ROS和MDA水平，同时恢复高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、三磷酸腺苷（ATP）和呼吸控制率（RCR）（p < .05或p < .01）。此外，GQ上调PINK1、Parkin及LC3-II/LC3-I比值，同时下调P62和TOM20表达（p < .05或p < .01），并伴随肝细胞和线粒体结构恢复。3-MA可消除GQ的有益作用。结论：黄芪-葛根配伍通过激活PINK1/Parkin信号通路促进肝脏线粒体自噬并恢复自噬流，从而显著改善T2DM大鼠胰岛素抵抗。

研究背景：2型糖尿病（T2DM）是以胰岛素抵抗（IR）为特征的代谢性疾病，IR贯穿病程，积极改善IR是治疗T2DM的关键策略。长期高脂饮食可使脂肪酸超过脂肪组织储存能力，以游离脂肪酸（FFA）形式在肝脏等非脂肪组织异位沉积，导致肝脏IR并进展为全身IR。线粒体是细胞主要产能细胞器，健康线粒体可抑制肝脏脂肪酸异常沉积；线粒体自噬（mitochondrial autophagy）作为选择性自噬，负责及时清除受损线粒体、维持线粒体质量。既往研究表明，功能失调或受损线粒体增多可能是T2DM IR发生的重要因素，激活线粒体自噬可加速脂肪酸氧化、抑制肝脂沉积。PINK1/Parkin（PTEN诱导激酶1/E3泛素连接酶）是线粒体自噬经典通路。现有西药虽种类增多，但仍存在低血糖、胃肠道反应、肝损伤、耐药等副作用；黄芪-葛根配伍（GQ）首载于《Zheng Lei Hui Bu》（Compendium of Patterns and Therapies），具有补脾益气、养阴清热、生津止渴功效，临床常用于“消渴”。研究人员前期药理研究证实GQ可改善T2DM大鼠IR程度、降低FBG及ROS、FFA水平并改善线粒体结构，故推测其改善IR可能通过促进线粒体自噬实现。基于此，研究人员建立T2DM IR大鼠模型，给予GQ、CCCP（线粒体自噬诱导剂）或3-MA（自噬抑制剂）干预4周，检测糖脂、氧化应激、肝组织学、线粒体超微结构及LC3-II/I、PINK1、Parkin、TOM20、TIM23、P62表达。结论显示，GQ可显著降低FBG、HOMA-IR、FFA、ROS、MDA，恢复HDL-C、GSH、SOD、ATP、RCR；上调PINK1、Parkin及LC3-II/LC3-I比值，下调P62和TOM20；3-MA可取消GQ获益。该研究首次证实GQ经PINK1/Parkin通路调控线粒体自噬改善T2DM IR，为临床应用提供实验依据，也为中医药靶向线粒体自噬干预代谢性疾病提供新思路。

关键技术方法（不超过250字）：动物来源于江西中医药大学动物中心，SPF级雄性SD大鼠60只，体重160 ± 20 g，合格证号SYXK（赣）2022-0002。采用高脂饮食4周联合尾静脉注射1% STZ 25 mg/kg诱导模型，FBG≥11.7 mmol/L为成模标准；模型组随机分为Model、GQ、CCCP、GQ+3-MA组，干预4周。检测FBG、血脂、肝功能、FFA、FINS及HOMA-IR/IAI；比色法测GSH、MDA、SOD，流式细胞术测ROS；分离肝线粒体测ATP、RCR、JC-1；HE染色和透射电镜观察肝组织及线粒体形态；Western blot检测LC3-I、LC3-II、PINK1、Parkin、TOM20、TIM23、P62及β-actin；SPSS 25.0统计。

研究结果：一般情况：Control组反应灵敏、活动正常、毛发光亮，尿量饮水量正常；Model组精神差、体重下降、毛暗干、脱毛、尾部溃疡、活动减少、聚集，尿量饮水量显著增加；各治疗组不同程度缓解。建模过程中9只死亡，48只模型组存活39只，剩余样本满足统计分析要求。FBG、FINS、HOMA-IR和IAI水平比较：与Control组比，各组给药前后FBG均显著升高（p < .01），证实模型成功；GQ和CCCP组给药后FBG较Model组显著降低（p < .01）。Model组FINS、HOMA-IR升高、IAI降低（p < .01）；GQ和CCCP组FINS降低（p < .05）、HOMA-IR降低（p < .01）、IAI升高（p < .01）。肝功能、血脂和FFA水平比较：Model组AST、ALT升高（p < .01）；GQ和CCCP组ALT降低（p < .05），GQ组AST降低（p < .05），CCCP组AST下降不显著（p > .05）；Model组TC、TG、LDL-C升高（p < .01）；GQ和CCCP组TC、TG降低（p < .01）、LDL-C降低（p < .05）；Model组FFA升高（p < .01），GQ和CCCP组FFA降低（p < .01）。GSH、MDA、ROS和SOD活性/水平比较：Model组GSH、SOD降低（p < .01），MDA、ROS升高（p < .01）；GQ和CCCP组GSH、SOD升高（p < .05），MDA、ROS降低（p < .01）。肝线粒体JC-1、ATP和RCR水平比较：Model组JC-1、ATP、RCR降低（p < .01）；GQ和CCCP组升高（p < .05）。肝组织病理变化：Control组肝细胞排列整齐、肝小叶结构清晰，无明显炎性细胞浸润、空泡或脂肪变性；Model组肝细胞排列紊乱肿大、核染色加深、炎性细胞浸润、广泛空泡和脂肪变性；GQ和CCCP组不同程度改善；GQ+3-MA组无改善，肝细胞肿胀、炎性浸润、广泛空泡和脂肪变性。各组大鼠肝组织线粒体形态变化：Control组线粒体形态规则、分布广，内外膜光滑、嵴相邻、颗粒基质中等电子密度；Model组线粒体核周聚集、嵴损伤或丢失、基质深、外膜不规则，并见线粒体空泡及线粒体自噬体；GQ和CCCP组正常线粒体比例增加、线粒体溶酶体减少，形态和分布改善。肝组织LC3-I、LC3-II、PINK1、Parkin、TOM20、P62和TIM23蛋白表达水平：结果部分报告Model组较Control组LC3-II、PINK1、Parkin及LC3-II/LC3-I比值升高（p < .01），TOM20、TIM23、P62降低（p < .01）；与Model组比，GQ和CCCP组LC3-II、PINK1、Parkin及比值升高（p < .01），TOM20降低（p < .01），TIM23降低但差异不显著（p > .05），P62降低（p < .05）。讨论部分总结：T2DM占DM 90%以上，IR和胰岛β细胞功能障碍是核心病理生理特征；西药存在低血糖、胃肠道反应、肝损伤、耐药等副作用。中医将T2DM IR归为“消渴”，认为脾虚为根本，“脾虚致渴”；黄芪补脾益气升阳，葛根生津止渴，2:1配伍有效成分溶出最高且经济，前期动物实验证实GQ对T2DM IR的药理作用且未见不良反应。讨论指出GQ可降低FBG、FINS、LDL-C、AST、ALT、TC、TG、HOMA-IR，升高HDL-C、IAI；中医理论将血糖归“水谷精微”，胰岛素为“脾气散精”物质基础，线粒体为“脾”的微观物质基础，线粒体自噬功能与脾代谢功能相关。高脂饮食致FFA异位沉积、肝IR并进展为全身IR；线粒体损伤、ROS过多、氧化应激、IR形成恶性循环；线粒体自噬可清除受损线粒体、促脂肪酸氧化、抑肝脂沉积、改善IR。PINK1/Parkin为经典通路，LC3-II与自噬体形成相关，P62反映自噬流完整性，TOM20/TIM23为线粒体标志并在线粒体自噬中降解。讨论将Model组P62升高解释为自噬流阻断、不能有效清除受损线粒体和异常物质；GQ和CCCP升高PINK1、Parkin、LC3-II并降低P62，表明经PINK1/Parkin促进自噬体形成、提高自噬流活性、及时清除受损线粒体、ROS和异位FFA，维持线粒体功能、恢复脂代谢、增强胰岛素靶器官敏感性。讨论还称首次证实GQ经PINK1/Parkin调控线粒体自噬改善T2DM IR，与黄连温胆汤、葛根芩连汤相比配伍简单、机制明确；与CCCP阳性对照类似，3-MA取消获益验证线粒体自噬核心地位；局限为未纳入体外实验，具体活性成分和直接作用靶点待后续研究。需注意：结果部分报告Model组P62表达降低（p < .01），而讨论部分称Model组P62升高并归因于自噬流阻断，原文两处表述不一致，建议作者核对。研究结论翻译：本研究证实黄芪-葛根配伍可通过激活PINK1/Parkin通路调控肝组织线粒体自噬，恢复自噬流，清除受损线粒体并改善线粒体功能，从而减轻T2DM大鼠IR。该研究为该药对临床治疗T2DM提供实验证据，也为中医药靶向线粒体自噬干预代谢性疾病提供新思路。然而，其具体活性成分和直接作用靶点仍需后续体外实验进一步探索。