华泽兰根中新型羽扇豆烷型三萜化合物3β-(3-呋喃甲酰氧基)-白桦脂酸的分离鉴定及其抗鼻咽癌活性研究

《Pharmacognosy Magazine》：A New Compound Extracted from the Roots of Eupatorium chinense and its Anti-cancer Activity Against Nasopharyngeal Carcinoma

　　

专业摘要翻译： 背景：华泽兰（Eupatorium chinense）的提取物含有多种生物活性化合物。已有报道指出，华泽兰根部的CHCl?可溶性提取物对人鼻咽癌细胞系2（CNE2）表现出显著的细胞毒性活性。 目的：从华泽兰根部鉴定新型化合物，作为进一步开发为鼻咽癌（NPC）治疗药物的候选分子。 材料与方法：研究人员对干燥的华泽兰根块茎进行提取和分离。通过广泛的波谱分析，包括一维核磁共振（NMR）（1H和13C NMR）、二维NMR技术（异核单量子相干（HSQC）和异核多键相关（HMBC））、高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）以及红外（IR）和紫外（UV）光谱，对新化合物的结构进行了全面解析。基于特征耦合常数（JH-2β/H-3α = 11.4 Hz）及与文献NMR数据的比较，确定了C-3位的β构型。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测所提取化合物对CNE2细胞、5-8F细胞、人口腔鳞状细胞癌细胞系4（SCC-4）细胞和H1299细胞的细胞毒性。 结果：从华泽兰根部的CHCl?可溶性部分获得了一种新型三萜化合物（化合物1）以及六种已知化合物（化合物2–7）。波谱和理化表征确定了该新化合物的结构。MTT法检测显示，化合物1对CNE2和5-8F细胞系表现出显著的细胞毒性，其半数抑制浓度（IC50）值分别为6.07 ± 0.9 μM和3.62 ± 0.7 μM。 结论：从华泽兰根块茎中分离得到的新型三萜化合物（化合物1）对NPC细胞系（CNE2和5-8F）表现出显著的体外细胞毒性。虽然这凸显了其作为进一步研究候选药物的潜力，但其用于NPC治疗的转化潜力仍需严格的体内验证和深入的机制研究。

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一、研究背景与科学问题

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是华南地区和东南亚地区的主要恶性肿瘤之一，具有高转移潜能，其发病率较西方人群高出20–30倍。当前NPC的标准治疗主要依赖铂类化疗联合放疗，但这些方案伴随显著的毒性和治疗耐药性，临床亟需源自替代来源的新型治疗药物。华泽兰（Eupatorium chinense L.）隶属于菊科，是中国传统药用植物，俗称“华泽兰”“土牛膝”或“多须公”，其根部在土家族和苗族民间长期用于治疗咽炎、白喉等多种咽喉疾病。现代药理学研究表明，华泽兰提取物含有三萜类、倍半萜类、甾体类和苯并呋喃类等多种生物活性化合物，具有抗炎、抗癌、抗氧化应激诱导的肌肉损伤保护及增强葡萄糖摄取等活性。既往研究虽已对华泽兰的抗癌效应取得一定进展，但其化学成分和生物活性仍需深入探究。值得注意的是，华泽兰的传统用药区域与NPC的地域流行分布高度重叠，且研究人员的初步数据显示其粗提物对CNE2细胞具有显著细胞毒性（IC₅₀ = 48.24 μg/mL），这为系统研究华泽兰来源化合物作为NPC治疗候选药物提供了有力依据。此外，从Eupatorium属植物中已分离出多种羽扇豆烷型三萜类化合物，如白桦脂酸、羽扇豆醇及其简单衍生物，但带有杂芳酰基取代基（特别是呋喃甲酰氧基）的白桦脂酸衍生物在该属中尚未见报道。

二、研究内容与主要结论

研究人员从华泽兰根部的CHCl?可溶性部分中分离获得一种新型三萜化合物（化合物1）及六种已知化合物（化合物2–7）。通过广泛波谱分析，化合物1被结构鉴定为3β-(3-呋喃甲酰氧基)-白桦脂酸（3β-(3-furancarbonyloxy)-betulinic acid），其C-3位独特的3-呋喃甲酰氧基取代在Eupatorium属三萜化合物中属首次报道。MTT法检测结果显示，化合物1对NPC细胞系CNE2和5-8F表现出显著细胞毒性，IC₅₀值分别为6.07 ± 0.9 μM和3.62 ± 0.7 μM，其效力较化合物2和7高3–23倍。化合物1对SCC-4和H1299细胞亦表现出中等细胞毒性（IC₅₀ < 25 μM），但对NPC细胞系的选择性更强（效力高2–5倍）。该研究提供了一种具有进一步研究价值的新型三萜候选分子，为NPC治疗研究提供了新方向。

三、关键技术方法

研究人员采用75%乙醇回流提取干燥华泽兰根块茎（10.0 kg），获得粗提物（486.3 g），依次经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，对乙酸乙酯可溶部分（63.5 g）进行CH?Cl?–MeOH梯度洗脱、PE–EtOAc梯度洗脱及十八烷基硅烷（ODS）柱层析，最终通过高效液相色谱（HPLC）纯化获得目标化合物。化合物结构通过一维核磁共振（NMR）（1H和13C NMR）、二维NMR技术（异核单量子相干（HSQC）和异核多键相关（HMBC））、高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）、红外（IR）和紫外（UV）光谱综合解析确定。细胞毒性评价采用MTT法，以阿霉素为阳性对照、DMSO为阴性对照，检测化合物对CNE2、5-8F、SCC-4和H1299四种细胞系的抑制作用。植物材料采集自中国河南省孟州市，由郑州大学生命科学学院黄军教授鉴定，凭证标本（编号20210807）保存于同一机构。

四、研究结果

新化合物结构鉴定：化合物1经HRESIMS分析显示[M?H]?离子峰为m/z 549.3577（对应分子式C₃₅H₅₀O₅）。1H NMR谱显示六个甲基单峰、一个含氧次甲基（δ_H 4.51, dd, J = 11.4, 4.8 Hz）、烯烃质子、三个芳香质子及一个羰基质子。13C NMR和HSQC显示35个碳，包括一个羰基（δ_C 177.3）、烯烃碳和含氧次甲基（δ_C 79.8），提示羽扇豆烷型三萜骨架。关键HMBC相关信号确认了3-呋喃甲酰氧基片段的存在。C-3位β构型通过J_H-2β/H-3α耦合常数（11.4 Hz）及与白桦脂酸3β-咖啡酸酯的NMR数据比较确定。

已知化合物鉴定：六种已知化合物通过波谱数据与文献比较分别鉴定为白桦脂酸（2）、glochidol（3）、3β-乙酰氧基-羽扇-12,20(29)-二烯（4）、7α-羟基谷甾醇（5）、7β-羟基谷甾醇（6）和9,11-脱氢麦角甾醇过氧化物（7）。

细胞毒性评价：MTT法检测显示，化合物1对CNE2（IC₅₀ = 6.07 ± 0.9 μM）、5-8F（IC₅₀ = 3.62 ± 0.7 μM）、SCC-4（IC₅₀ = 20.51 ± 1.2 μM）和H1299（IC₅₀ = 19.32 ± 1.0 μM）细胞均表现出细胞毒性。化合物2和7显示中等细胞毒性，而化合物3–6对所有测试细胞系均无显著细胞毒性（IC₅₀ > 100 μM）。阳性对照阿霉素的IC₅₀值范围为0.89 ± 0.9 μM（5-8F）至1.57 ± 0.7 μM（SCC-4）。

五、讨论与结论

讨论部分指出，化合物1的C-3位3-呋喃甲酰氧基取代是其在Eupatorium属中前所未有的结构特征，该吸电子呋喃甲酰基可能通过调节化合物的亲脂性和电子性质，促进膜通透性或改善与细胞内靶标的相互作用，从而增强抗癌效力。相比之下，缺乏该结构修饰的白桦脂酸（化合物2）细胞毒性显著较低，凸显了呋喃甲酰氧基对活性优化的关键作用。研究也承认了MTT法的局限性，即其反映的是线粒体代谢活性抑制而非直接定量细胞死亡，无法区分凋亡、坏死或自噬，需要流式细胞术凋亡检测、细胞周期分析、克隆形成存活实验等补充验证。此外，研究还指出CNE2和5-8F细胞系已知存在HeLa污染，可能影响结果的普适性；缺乏对正常细胞系的毒性数据，无法评估选择性指数；体内研究尚需开展以验证疗效和安全性。

研究结论为：研究人员从华泽兰根块茎的CHCl?可溶性部分中分离并结构鉴定了新型三萜化合物3β-(3-呋喃甲酰氧基)-白桦脂酸（化合物1）及六种已知化合物。化合物1对NPC细胞系CNE2（IC₅₀ = 6.07 ± 0.9 μM）和5-8F（IC₅₀ = 3.62 ± 0.7 μM）表现出显著的体外细胞毒性，凸显其作为NPC治疗候选分子的潜力。未来研究将聚焦于使用非HeLa污染的NPC细胞系验证其细胞毒性、探索其潜在抗癌机制（如凋亡或铁死亡诱导）以及评估其体内疗效，以支持转化开发。