血管内皮生长因子A诱导成年小鼠后脑非神经发生脑室周围区域成年神经前体细胞增殖

《NeuroReport》：Vascular endothelial growth factor A induces proliferation of adult neural progenitor cells in non-neurogenic periventricular regions of the adult mouse hindbrain

　　

**背景**

除侧脑室室管膜下区（V-SVZ）这一已充分建立的神经营养区域外，神经干细胞/祖细胞（NPCs）也在成年小鼠整个脑室系统的脑室周围区域（PVRs）中被鉴定出来。然而，这些NPCs在神经可塑性或神经修复中的潜在作用仍基本未被探索。

**目的**

鉴于血管内皮生长因子A（VEGF-A）已被证明能促进V-SVZ中干细胞的增殖，本研究旨在探讨VEGF-A对间脑和后脑PVRs中NPCs增殖的影响。

**方法**

健康的成年雄性C57BL/6小鼠接受连续7天的脑室内持续灌注VEGF-A或人工脑脊液。为标记增殖细胞，每日注射胸苷类似物。在内侧脑室内侧壁、第三脑室以及中脑导水管/第四脑室（后脑）的PVRs中评估增殖情况。

**结果**

与对照组相比，持续VEGF-A灌注显著增加了第三脑室和后脑PVRs的整体细胞增殖，但并未影响内侧脑室内侧壁的增殖。在后脑PVRs中，增殖的增加仅限于GFAP?Sox2? NPCs。相反，在第三脑室壁中，VEGF-A灌注导致室管膜细胞增殖显著减少，未观察到其他细胞类型有特异性增加。

**结论**

虽然持续脑室内VEGF-A灌注增强了间脑和后脑PVRs中NPCs的增殖，但增殖细胞的总数仍然较低，且未观察到显著的谱系分化。这些发现对 resident NPCs在这些脑区中提出的神经修复作用提出了质疑，尤其是在帕金森病等神经退行性疾病的情况下。

**引言**

成年神经发生是一个已被充分表征的现象，最初在成年哺乳动物大脑的两个离散区域被描述：侧脑室壁的室管膜下区（V-SVZ）和海马齿状回。V-SVZ由一组层级组织的神经细胞群组成。B1型细胞代表该神经区域内真正的神经干细胞（NSCs）；它们通过特化的终足与局部血管保持接触，并共表达星形胶质细胞和干细胞标志物，包括胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Sox2。激活后，B1细胞进行自我更新并产生快速分裂的过渡扩增祖细胞（C型细胞），其特征是表达表皮生长因子受体。这些祖细胞随后产生神经母细胞（A型细胞），这些细胞表达双皮质素（DCX）和多唾液酸化神经细胞粘附分子，并沿前向迁移流迁移至嗅球，分化为多种中间神经元亚型[1]。除神经元更新外，V-SVZ还参与少突胶质细胞生成，涉及成年大脑中的髓鞘可塑性[2]。

在人类中，成年神经发生的研究要晚得多。在成年海马中，显著的神经元更新贯穿整个生命周期持续存在[3,4]，并与维持认知功能和情绪调节相关[5]。关于V-SVZ神经发生，近期研究支持人类纹状体中间神经元持续更新[6]。

成年NSCs也在多种曾被认为非神经发生的哺乳动物脑区中被报道，包括新皮层、纹状体、下丘脑和黑质[7]。然而，这些增殖细胞究竟代表具备长期自我更新能力的真正NSCs，还是更具局限性的祖细胞群，仍存在持续争议。因此，在本研究中，这些细胞将被称为神经祖细胞（NPCs），以符合当前文献惯例[8]。我们实验室及其他团队此前已表征了成年小鼠脑PVRs中驻留的成年NPCs（aNPCs）[9–11]。与V-SVZ不同，间脑和后脑PVRs缺乏结构化的室管膜下区，且不含过渡扩增祖细胞或神经母细胞。虽然在体内无法检测到这些区域中活跃增殖的细胞，但在体外可从整个脑室系统的PVRs中获得具有增殖能力的aNPCs[9]。此前，我们鉴定出去甲肾上腺素是这些静息aNPCs的关键负调节因子。在没有去甲肾上腺素的情况下，在体内可检测到第三脑室（3V）-PVR和中脑导水管周围有增殖细胞。然而，DCX?神经母细胞的数量仍然较低，大部分增殖活动发生在NG2?胶质细胞中[11]。

除其在血管生成中的公认作用外[12]，多项体外研究已证明VEGF具有神经保护特性[13,14]。此外，VEGF-A已被证明可在体内和体外促进V-SVZ和齿状回中aNSCs的增殖[15,16]。

迄今为止，VEGF对驻留在间脑和后脑PVRs中NPCs的影响尚未被系统研究。这些NPCs在体内主要处于静息状态，但具备在体外产生新神经元的内在能力[9,10]。因此，它们可能代表一种此前未被充分探索的神经修复潜力来源。在本研究中，通过渗透微型泵对健康的年轻成年小鼠进行持续7天的脑室内VEGF-A或人工脑脊液（aCSF）灌注。每日VEGF-A剂量（240 ng/天）根据文献选择，采用促进V-SVZ和齿状回增殖的剂量方案[15]。为标记增殖细胞，每日进行腹腔注射胸苷类似物。这种方法使得能够量化成年小鼠脑PVRs中的细胞增殖，特别是在传统上被认为非神经发生的区域。

**方法**

**动物**

所有操作均经主管当局批准（Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Bad Langensalza, Thüringen, 德国；TVV 02-023/09），并按照《动物研究：体内实验报告》（ARRIVE）指南和欧盟（EU）指令2010/63/EU执行。本研究使用12只雄性C57BL/6小鼠，实验开始时年龄为8–12周。

**动物与手术**

进行脑室内灌注时，渗透微型泵（流速0.5 μL/h；总体积100 μL；Durect Corporation, Cupertino, California, 美国）分别填充aCSF（Sigma-Aldrich, Gillingham, 英国）或溶于aCSF中的20 μg/mL人源VEGF-A???（Sigma-Aldrich；240 ng/天）。该特定剂量已被证明可促进V-SVZ和齿状回的增殖[15]。将小鼠置于立体定位框架中（Stoelting Neuroscience, Dublin, 爱尔兰），使用异氟烷麻醉（5% 1分钟，随后2.5–3.5%配0.8 L O?/min；Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei?heim, 德国）。然后沿颈部向左侧上肢方向做小切口以安置微型泵。随后暴露颅骨，在以下相对于前囟和硬脑膜的坐标处钻一个小骨孔：前后?0.5 mm；内侧-外侧1.3 mm，依据Paxinos和Franklin的研究[17]。然后将渗透微型泵灌注套件（ALZET脑灌注套件2；Durect Corporation）的导管插入右侧侧脑室至深度2.5 mm，并如先前所述[11,18]用水门汀固定于颅骨上。植入前，渗透微型泵按照制造商说明书在37°C无菌生理盐水中激活1小时。手术后，动物被放回其笼中，再继续饲养7天（见图1a实验设置）。

**标记增殖NPC**

实验期间（第1–7天）每日腹腔注射5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU；57.5 mg/kg体重；0.9%生理盐水中含23 mg/mL、0.2 N NaOH；Sigma-Aldrich），并在实验最后一天单次腹腔注射5-氯-2'-脱氧尿苷（CldU；42.5 mg/kg体重；0.9% NaCl中17 mg/mL；MP Biochemicals, Santa Anna, California, 美国）。最初，我们计划分别定量IdU?和CldU?细胞，但由于PVRs中增殖细胞数量较少，我们选择了可同时检测IdU和CldU的一抗；增殖细胞此后命名为xdU?。实验结束时，小鼠接受酮胺/唑啉腹腔过量注射[50 mg/kg体重酮胺（Pfizer, New York, New York, 美国）+ 5 mg/kg体重唑啉（Bayer Healthcare, Leverkusen, 德国）]，用冰冷0.9%生理盐水灌注，随后用4%多聚甲醛（PFA, Sigma-Aldrich）灌注。取出脑组织，在4% PFA中保存过夜，转入30%蔗糖溶液，快速冷冻，并保存在?80°C直至进一步处理。

**免疫荧光**

将小鼠脑组织用滑动切片机（SM2010R, Leica Microsystems, 德国）切成30 μm厚的冠状切片，保存在?20°C直至进一步处理。我们为不同PVRs选择以下坐标：相对于前囟，0.98–0.02 mm用于侧脑室内侧壁（LVM），0.02至?2.7 mm用于第三脑室，?3.4至?4.84 mm用于中脑导水管，?5.34至?6.24 mm用于第四脑室（4V）[17]。免疫荧光操作基本如先前所述[11]。简言之，游离冰冻切片（每隔六张切片）先在含3%驴血清（Jackson ImmunoResearch, Ely, 英国）和0.2% Triton X-100（Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, 美国）的1× Tris缓冲盐水（TBS；Dako, 德国）中预处理30分钟（室温，RT），然后在4°C下与以下一抗孵育过夜：绵羊抗BrdU（用于检测IdU和CldU；1:250；RRID:AB_302659；Abcam, Cambridge, 英国）、山羊抗DCX（1:100；RRID:AB_2088491；Abcam）、鸡抗GFAP（1:1000；RRID:AB_2818977；Abcam）、兔抗NG2软骨素硫酸蛋白聚糖（1:200；RRID:AB_11213678；Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, 美国）和兔抗Sox2（1:200；RRID:AB_10585428；Abcam）。次日，切片用1× TBS多次洗涤，然后在室温下与适当的荧光偶联二抗孵育1小时（1:500；均来自Molecular Probes, Eugene, Oregon, 美国）。为检测xdU掺入，切片在应用一抗前先在37°C下于2 N HCl中孵育30分钟，随后按上述方法染色。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI, Sigma-Aldrich）复染。

**成像与定量**

每隔第六张切片分析V-SVZ、LVM（对侧于脑室内导管）、第三脑室、中脑导水管和第四脑室，使用Zeiss Axioplan 2显微镜（Carl Zeiss, Jena, 德国）配合StereoInvestigator 7.50.4软件（MBF Bioscience, Williston, North Dakota, 美国）的光学分拣法（用于xdU?细胞总数定量），或使用Axio Observer Z1配合ZEN Blue软件（均购自Carl Zeiss；用于细胞类型分析）。由于后脑PVRs中xdU?细胞数量相当低，将中脑导水管和第四脑室合并为后脑PVRs（HBAQ/4V）。结果根据每个脑区每只动物分析的切片总数进行校正。在每个区域中，PVR定义为围绕脑室壁向外200 μm的区域，如先前报道[9]。

**统计学**

所有统计分析使用SPSS（版本29；IBM, Armonk, New York, 美国）进行。数据可视化，包括绘图和图表，使用GraphPad Prism（版本9.4.1；GraphPad Software, San Diego, California, 美国）和BioRender（BioRender.com；Toronto, 加拿大）进行。使用稳健回归和离群值移除方法识别异常值。数据分布的正态性通过Shapiro-Wilk检验评估，方差齐性通过Levene检验评估。组间均值或中位数差异分别使用双尾非配对Student t检验、Welch t检验或Mann-Whitney U检验评估，视情况而定。

P 值 <0.05 被认为具有统计学意义。
结果
血管内皮生长因子 A 增加成年小鼠大脑中脑和后脑室周区域的增殖
由于本研究旨在调查血管内皮生长因子 A（VEGF-A）对所谓非神经发生室周区域（PVRs）内细胞增殖的影响，因此每日施用胸苷类似物以最大限度地增加标记神经前体细胞（NPCs）的数量，导致室下区（V-SVZ）中密集堆积的 xdU 阳性细胞，无法再可靠地量化（见图 S1，补充数字内容 2，https://links.lww.com/WNR/A874）。在连续 7 天脑室内输注 VEGF-A（240 纳克/天）或人工脑脊液（aCSF，对照组）后，我们评估了侧脑室侧壁（LVM）、第三脑室（3V）和后脑室周区域（HBAQ/4V）PVRs 中增殖细胞的总数（通过累积胸苷类似物掺入表示）。动物每日接受腹腔注射 IdU（共 6 次），并在心脏灌注前一天接受单次 CldU 注射。由于尾侧 PVRs 中增殖细胞数量较少，使用同时与两种类似物交叉反应的 BrdU 抗体联合量化 IdU 阳性和 CldU 阳性细胞，并选择术语 xdU 阳性细胞（图 1b）。
在 LVM 中，对照组动物表现出 1265 ± 53 个标记细胞，而 VEGF-A 处理组动物显示 1035 ± 343 个细胞（P = 0.60）。相比之下，VEGF-A 组的 3V-PVR 显示 xdU 阳性细胞显著增加（555 ± 95），与对照组相比（244 ± 74；P = 0.04）。同样，对联合 HBAQ/4V 的分析显示，与对照组（90 ± 27）相比，VEGF-A 处理动物（692 ± 148）的增殖显著增加（P = 0.001；图 1c）。
血管内皮生长因子 A 对神经前体细胞和神经母细胞的影响
我们接下来调查了 VEGF-A 是否特异性作用于神经发生级联中的某些细胞类型。7 天后，VEGF-A 未改变 LVM（7 ± 3 对 6 ± 4 个细胞；P = 0.29）或 3V（2 ± 1 对 9 ± 4 个细胞；P = 0.19）中 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 的增殖，但在 HBAQ/4V 中显著增加增殖（4 ± 2 对 23 ± 7 个细胞；P = 0.03；图 2a，b）。此外，VEGF-A 未影响所检查区域中（非增殖）GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 的绝对数量，细胞计数如下：LVM（对照组与 VEGF-A 组），58 ± 10 对 45 ± 12（P = 0.43）；3V，43 ± 17 对 53 ± 10（P = 0.79）；HBAQ/4V，83 ± 28 对 73 ± 18（P = 0.76；图 2c）。xdU 阳性 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 的比例（% xdU 阳性 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs/总 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs）在所有检查的 PVRs 中也保持不变（图 2d）。
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图 2
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血管内皮生长因子 A 对室周区域神经前体细胞的影响。(a) 侧脑室侧壁（上方面板）、第三脑室（中间面板）和后脑室周区域（导水管和第四脑室；下方面板）的代表性免疫荧光图像，经持续 7 天脑室内施用 aCSF（对照条件，左方面板）或 VEGF-A（右方面板）处理后。免疫荧光鉴定 xdU（IdU、CldU 或两者；绿色）、Sox2（白色）和 GFAP（红色）；细胞核用 DAPI 复染（蓝色）。标记阳性细胞由白色箭头指示。比例尺，20 微米。(b) 与对照组相比，持续脑室内 VEGF-A 输注增加了后脑室周区域（HBAQ/4V；P = 0.03）中 xdU 阳性 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 的数量；然而，侧脑室侧壁和第三脑室的增殖分别保持不变。(c) 与对照组相比，持续脑室内 VEGF-A 输注未改变侧脑室侧壁、第三脑室和后脑区域的 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 计数。(d) xdU 阳性 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 的百分比在任何检查的 PVRs 中均未改变。GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 每第六张冠状切面量化，结果乘以六。数据以箱线图呈现，中心标记为中位数，箱体的下边缘和上边缘分别为第 25 和第 75 百分位数，须为最小值/最大值（点代表个体值）。P 值来自 Welch's t 检验。3V，第三脑室；aCSF，人工脑脊液；CldU，氯脱氧尿苷；CTRL，对照；DAPI，4',6-二脒基 -2-苯基吲哚；GFAP，胶质纤维酸性蛋白；HB，后脑（导水管 + 第四脑室）；IdU，碘脱氧尿苷；LVM，侧脑室侧壁；NPC，神经前体细胞；PVR，室周区域；VEGF-A，血管内皮生长因子 A。
谱系进展在神经母细胞中进行评估，与对照组相比，VEGF-A 处理动物的 LVM 中 xdU 阳性 DCX 阳性增殖神经母细胞数量显著较高（10 ± 5 对 40 ± 15 个细胞；P = 0.02），而在 3V（0 ± 0 对 0.3 ± 0.3 个细胞；P = 0.57）或 HBAQ/4V（0.3 ± 0.3 对 0 ± 0 个细胞；P = 0.55）中未观察到差异（图 3a，b）。此外，DCX 阳性神经母细胞总数未观察到显著差异：LVM，67 ± 13 对 149 ± 47（P = 0.12）；3V，6 ± 3 对 17 ± 3（P = 0.07）；HBAQ/4V，6 ± 3 对 4 ± 2（P = 0.71；图 3c）。就像 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 一样，xdU 阳性 DCX 阳性神经母细胞（对总 DCX 阳性神经母细胞）的百分比未受 VEGF-A 处理影响（图 3d）。
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图 3
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血管内皮生长因子 A 对室周区域神经母细胞的影响。(a) LVM（上方面板）、第三脑室（中间面板）和后脑（导水管和第四脑室；下方面板）的代表性免疫荧光图像，用于鉴定 xdU（Idu+、CldU+ 或两者）细胞（绿色）和 DCX 阳性神经母细胞（橙色）；细胞核用 DAPI 复染（蓝色）。比例尺，20 微米。(b) 与对照组相比，持续脑室内 VEGF-A 输注显著增加了侧脑室侧壁中 xdU 阳性 DCX 阳性神经母细胞的总数（P = 0.02），但在中脑和后脑室周区域中没有增加。(c) 与对照组相比，持续脑室内 VEGF-A 输注未改变侧脑室侧壁、第三脑室和后脑室周区域中 DCX 阳性神经母细胞的总数。(d) xdU 阳性 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 的百分比在任何检查的 PVRs 中均未改变。DCX 阳性神经母细胞每第六张冠状切面量化，结果乘以六。数据以箱线图呈现，中心标记为中位数，箱体的下边缘和上边缘分别为第 25 和第 75 百分位数，须为最小值/最大值（点代表个体值）。P 值来自 Welch's t 检验。*P < 0.05。3V，第三脑室；aCSF，人工脑脊液；CldU，氯脱氧尿苷；CTRL，对照；DAPI，4',6-二脒基 -2-苯基吲哚；GFAP，胶质丝相关蛋白；HB，后脑（导水管 + 第四脑室）；IdU，碘脱氧尿苷；LVM，侧脑室侧壁；VEGF-A，血管内皮生长因子 A。
在辅助分析中，我们确定了 VEGF-A 对波形蛋白阳性室管膜细胞增殖的影响。在 LVM 中，对照组和 VEGF-A 处理动物分别检测到 2 ± 1 和 4 ± 2 个 xdU 阳性波形蛋白阳性室管膜细胞（P = 0.46）。在 3V 中，VEGF-A 显著减少增殖（13 ± 3 对 2 ± 1 个细胞，P = 0.04），而在 HBAQ/4V 中未观察到显著差异（6 ± 3 对 12 ± 7 个细胞，P = 0.46；图 4a，b）。
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图 4
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血管内皮生长因子 A 对室周区域波形蛋白阳性室管膜细胞和 NG2 阳性少突胶质细胞前体细胞的影响。(a) 侧脑室侧壁的代表性免疫荧光染色，用于鉴定 xdU（Idu+、CldU+ 或两者）细胞（绿色）和波形蛋白阳性室管膜细胞（橙色）；细胞核用 DAPI 复染（蓝色）。比例尺，20 微米。(b) 持续脑室内 VEGF-A 输注显著减少了第三脑室室周区域中 xdU 阳性波形蛋白阳性室管膜细胞的数量，但在其他室周区域中没有减少。(c) 侧脑室侧壁的代表性免疫荧光染色，用于鉴定 xdU 阳性细胞（绿色）和 NG2 阳性少突胶质细胞前体细胞（橙色）；细胞核用 DAPI 复染（蓝色）。比例尺，20 微米。(d) 与对照组相比，VEGF-A 输注 8 天后，任何室周区域中 xdU 阳性 NG2 阳性少突胶质细胞前体细胞的数量均未改变。室管膜细胞和少突胶质细胞前体细胞每第六张冠状切面量化，结果乘以六。数据以箱线图呈现，中心标记为中位数，箱体的下边缘和上边缘分别为第 25 和第 75 百分位数，须为最小值/最大值（点代表个体值）。P 值来自 Welch's t 检验。3V，第三脑室；aCSF，人工脑脊液；CldU，氯脱氧尿苷；CTRL，对照；DAPI，4',6-二脒基 -2-苯基吲哚；HB，后脑（导水管 + 第四脑室）；IdU，碘脱氧尿苷；LVM，侧脑室侧壁；VEGF-A，血管内皮生长因子 A。
最后，对 NG2 阳性少突胶质细胞前体细胞的分析显示，在 LVM 中 VEGF-A 促使增殖增加呈上升趋势（9 ± 3 对 22 ± 6 个细胞；P = 0.06），而 3V（23 ± 13 对 46 ± 10 个细胞；P = 0.21）和 HBAQ/4V（8 ± 5 对 21 ± 7 个细胞；P = 0.19）中增殖未改变（图 4c，d）。
讨论
本研究提供了第一项证据，表明 VEGF-A 促进成年小鼠大脑中脑和后脑 PVRs 中的 NPC 增殖，这些区域传统上被认为是室周系统的非神经发生区域。我们之前证明，这些 PVRs 在结构组织和生理条件下体内缺乏活跃增殖细胞方面与侧脑室的 V-SVZ 显著不同，尽管它们保留了具有体外增殖潜力的细胞群体 [9]。与这些早期发现相反，本研究揭示了体内所有 PVRs 中增殖细胞数量较少，即使在控制条件下也是如此。这种差异可能归因于此处使用的延长胸苷类似物施用（7 天对 3 天）。除 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 外，我们在所有 PVRs 中检测到少量 DCX 阳性神经母细胞，尽管数量非常低。
VEGF-A 处理显著增加了中脑和后脑 PVRs 中的总细胞增殖，但未在 LVM 中增加。细胞命运分析显示，LVM 中 xdU 阳性 DCX 阳性神经母细胞数量显著增加，这与增强的谱系进展一致，而不是对增殖的主要影响。在后脑 PVRs 中，VEGF-A 选择性促进了 GFAP 阳性 Sox2 阳性 NPCs 的增殖，无下游谱系进展证据，如 xdU 阳性 DCX 阳性神经母细胞的近乎缺失所示。在 3V 周围，VEGF-A 处理增加了细胞增殖；然而，无法确定目标细胞群体的身份。值得注意的是，在先前的一项研究中，我们证明去甲肾上腺素显著抑制体内尾侧 NPCs 的增殖能力。药理学拮抗去甲肾上腺素信号传导导致 3V 周围神经发生级联的多个阶段（包括 NPCs、神经母细胞和少突胶质细胞前体）增殖增加，而不影响室底细胞增殖 [11]。总之，这些发现表明 VEGF-A 对成年室周系统中不同的前体细胞群体发挥区域特异性效应。这种区域异质性强调了进一步研究 VEGF-A 介导的这些微环境增殖调节机制的必要性。
先前的研究证明 VEGF-A 具有剂量依赖性效应，较高剂量 240 纳克/天（此处使用）导致 V-SVZ-aNSCs 增殖增加，与低剂量方案（2.4 纳克/天）相比 [15,16]。值得注意的是，后者研究还报告了 VEGF-A 对存活的主要影响，本研究未涉及此方面。如前所述，由于 VEGF-A 输注时间延长（7 天）且与先前方案一致 [17]，我们无法量化 V-SVZ 中的 xdU 标记细胞，因为该区域变得密集分布有免疫阳性细胞。因此，直接在同一动物内比较 V-SVZ 和中脑/后脑 PVRs 中的 VEGF-A 效应不幸的是不可行。虽然缺氧和缺血是 V-SVZ 神经发生的已确立调节因素 [19]，但中脑和后脑 PVRs 中的等效调节因素，本可能在本研究中引起额外兴趣，仍然定义不明确。
本研究的局限性包括样本量小，尽管与相关工作中的相当 [15,16]，且仅使用雄性小鼠。鉴于性激素已知影响 VEGF 信号传导和神经发生 [20]，这限制了我们的发现的推广性，尽管我们可以排除女性激素周期对 NPC 增殖的混杂影响。此外，我们未评估输注点远处的后脑区域脑脊液中 VEGF-A 动力学。我们的研究未分析过渡扩增细胞的增殖，这可能部分解释了增殖细胞计数的改变。此外，我们无法提供关于 VEGF-A 对血管内皮细胞或血管重塑影响的数据，这可能间接影响 PVRs 中的神经发生。如前所述，胸苷类似物的重复施用阻止了量化 VEGF-A 对 V-SVZ aNSC 增殖的影响，这是一个“传统”神经发生微环境。
总之，我们的发现提供了初步证据，表明 VEGF-A 增强 V-SVZ 之外的中脑和后脑 PVRs 中的增殖。然而，增殖细胞的总体数量较低，引发了关于我们结果治疗相关性的问题。

未来的研究应探讨新生细胞在 PVR 区域内的详细谱系进展和功能整合，以及 VEGF-A 对血管化的影响。

致谢
本工作得到了德国研究基金会（DFG）通过合作研究中心 CRC 1270“电活性植入物”（DFG; SFB 1270/1,2,3 – 299150580）对 A.S. 和 M.F. 的支持；M.F. 获得了罗斯托克大学医学中心 Else Hirschberg 女性发展计划和德国帕金森病与运动障碍学会（DPG）的研究资助。A.H. 获得了施蒂夫特联合组织内的 Hermann 和 Lilly Schilling 医学研究基金会的支持。

M.F. 负责形式分析和写作 – 初稿撰写。R.B. 负责调查和形式分析。S.K. 负责调查和写作 – 审阅与编辑。G.W. 负责调查和形式分析。C.R. 负责概念构思、资金获取和写作 – 审阅与编辑。A.H. 负责监督、资金获取和写作 – 审阅与编辑。A.S. 负责概念构思、监督、资金获取和写作 – 审阅与编辑。

支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。

所有动物实验均遵守欧盟指令（2010/63/EU）和 ARRIVE 指南，并获得了当地动物护理委员会的批准。

所有作者均已阅读并批准最终手稿。

R.B. 将这些数据包含在他的博士论文中。

利益冲突
不存在利益冲突。