Ebelin lactone（EL）对认知相关蛋白的多靶点计算谱分析及NRN1–EL复合物优先级评估

《Frontiers in Bioinformatics》：Comparative multi-target computational profiling of ebelin lactone across cognition-associated proteins

　　

背景：Ebelin lactone（EL）是一种通过酸水解产生的与bacoside相关的三萜类衍生物，既往显示对M₁毒蕈碱受体和5-HT_2A受体具有结合亲和力。然而，其与参与突触可塑性、神经元蛋白稳态、线粒体应激反应和神经突起重塑的蛋白的结构兼容性尚未被系统评估。方法：研究人员评估了EL与认知相关蛋白Alpha-actinin-4（ACTN4）、Brain-derived neurotrophic factor（BDNF）、Complexin-1（CPLX1）、Heat shock protein 72（HSP70-1）、Heat shock protein family member 9（HSPA9）和Neuritin（NRN1）的相互作用。工作流程整合了ADMET-AI预测、使用GNINA进行自动搜索空间生成和基于Vina的构象打分（pose scoring）的盲对接（blind docking）、对五个选定复合物及其相应apo形式进行的100纳秒（100-ns）GROMACS分子动力学模拟、轨迹分析、基于主成分的自由能景观（FEL）分析，以及带有逐残基能量分解的MM/GBSA结合能估计。结果：HSPA9显示最有利的对接分数(?9.13) kcal mol^?1，其次为ACTN4（?8.65）、BDNF（?8.57）、HSP70-1（?8.19）、NRN1（?7.87）和CPLX1（?7.00）。CPLX1未被推进至MD模拟，因为其具有较小的预测口袋且分数最不利。在100-ns MD模拟过程中，ACTN4片段具有最低的平均蛋白均方根偏差（RMSD）（0.163 ± 0.021 nm）。相比之下，BDNF的全前体模型显示最高的平均蛋白RMSD，为2.125 ± 0.388 nm。与相应apo轨迹比较显示靶标依赖性变化，NRN1–EL表现出低于apo NRN1的平均RMSD和均方根波动（RMSF），尽管其回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）值更高。NRN1表现出最高的平均蛋白–配体氢键计数（0.575 ± 0.501）和最负的MM/GBSA结合能估计（?39.21 ± 3.24 kcal mol^?1），其次为HSPA9（?37.93 ± 2.60）和BDNF（?33.83 ± 3.49）。ADMET结果表明高亲脂性（logP 7.018）、低水溶性和混合的渗透性相关信号。结论：基于整合发现，NRN1成为用于实验随访的整体最有前景的计算候选物。这些发现需要实验验证。

认知障碍（cognitive impairment）与突触可塑性（synaptic plasticity）、神经突起结构、线粒体平衡及蛋白稳态（proteostasis）等过程密切相关。2021年全球约5700万人受痴呆影响，每年新诊断近1000万例，但有效保护或恢复认知功能的手段仍有限。Bacopa monnieri (L.) Wettst长期用于增强记忆和认知功能，随机试验的系统综述和meta分析显示其对部分记忆和注意指标可能有优势，但研究异质性以及提取物、剂量和疗程差异限制广泛结论。Bacoside A为达玛烷型三萜皂苷混合物，酸水解可生成Ebelin lactone（EL，与bacoside相关的三萜类衍生物）和bacogenin A1。与母体bacoside相比，EL氢键基团较少、极性表面积较小，可能改善膜分配，但也可能增加疏水性并降低水溶性。既有研究报道EL对M₁毒蕈碱受体和5-HT_2A受体具有微摩尔结合亲和力，并具有优于母体糖苷的预测CNS药物样性质；然而，EL与参与神经元结构、突触功能和细胞韧性的认知相关蛋白的潜在相互作用尚未系统探索。基于此，研究人员在统一的对接与分子动力学工作流程中比较EL对六种认知相关蛋白的预测行为，以进行相对优先级评估。

研究人员围绕六种人认知相关蛋白开展比较计算研究：ACTN4（Alpha-actinin-4，α-辅肌动蛋白4）、BDNF（Brain-derived neurotrophic factor，脑源性神经营养因子）、CPLX1（Complexin-1，复合素1）、HSP70-1（Heat shock protein 72，热休克蛋白72）、HSPA9（Heat shock protein family A member 9，mortalin/GRP75）和NRN1（Neuritin，神经突起素）。这些靶标依据文献证据与认知韧性、突触可塑性或功能、蛋白稳态、线粒体应激反应或神经突起发育的关联入选，并结合可获得的人源可用结构输入。研究结论为：综合对接、100 ns分子动力学、自由能景观和MM/GBSA结果，NRN1–EL在受检复合物中被优先用于实验随访；NRN1为整体最有前景的计算候选物，HSPA9虽具最有利对接分数和相近有利MM/GBSA估计，但综合结果不足以优先于NRN1。该研究的意义在于为EL–NRN1及EL–HSPA9预测相互作用提供假设生成依据，并提示后续需实验验证。

关键技术方法概括（不超过250字）：本研究未使用临床样本队列；配体EL来自PubChem（CID：15559069），蛋白命名和参考序列经UniProt确认，结构坐标来自RCSB Protein Data Bank或AlphaFold Protein Structure Database。主要方法包括ADMET-AI预测；GNINA盲对接（blind docking）自动生成搜索空间并以Vina打分；GROMACS 2024.3对五个蛋白–EL复合物及其相应apo形式进行100 ns分子动力学（MD）模拟；轨迹分析包括均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、回转半径（Rg）、氢键和溶剂可及表面积（SASA）；主成分分析（PCA）和自由能景观（FEL）分析；gmx_MMPBSA进行MM/GBSA结合能估计及逐残基能量分解。CPLX1–EL因对接分数最低且预测口袋较小未进入MD。

3.1 ADMET预测：通过ADMET-AI对EL的SMILES进行预测，得到分子量454.695 Da、计算logP 7.0181、氢键受体3个、氢键供体1个、拓扑极性表面积46.53 ?²、药物相似性定量估计0.36811；HIA Hou为0.992545、PAMPA NCATS为0.925511、Bioavailability Ma为0.44261、P-glycoprotein Broccatelli为0.821793、BBB Martins为0.206425、Caco-2 Wang为?5.23412；预测溶解度为?6.79951。结果提示高预测亲脂性和有限预测水溶性，并呈混合渗透性相关信号；因缺少端点特异性阈值、类别定义和置信信息，这些输出仅作为模型预测保留，未用于对肠道吸收、口服生物利用度或CNS暴露作确定性结论。

3.2 所选靶标的结构输入：ACTN4采用实验解析的PDB 2R0O，即237残基K255E肌动蛋白结合结构域片段，分辨率2.20 ?；BDNF、CPLX1、HSP70-1、HSPA9和NRN1采用AlphaFold预测模型。BDNF输入为前体蛋白；HSP70-1为151残基AF-Q9UQC1-F1模型；HSPA9输入为其679残基参考序列的1–380残基。不同输入在序列覆盖和结构来源上存在差异，解释对接和MD结果时需考虑。

3.3 分子对接与相互作用谱：通过GNINA盲对接和Vina打分评估EL与六靶标，得分范围为?9.13至?7.00 kcal mol^?1。HSPA9–EL得分最有利（?9.13），其次为ACTN4–EL（?8.65）、BDNF–EL（?8.57）、HSP70-1–EL（?8.19）、NRN1–EL（?7.87）和CPLX1–EL（?7.00）。常规氢键仅见于CPLX1–EL的LYS49和HSPA9–EL的ALA225；总体以范德华和疏水/π相关接触为主，符合EL刚性三萜骨架、高预测亲脂性及有限氢键能力。CPLX1–EL因得分最低且占据较小预测口袋未进入MD；该决定仅限MD阶段，不能解释为反对潜在EL–CPLX1相互作用。

3.4 分子动力学模拟研究：对ACTN4–EL、BDNF–EL、HSP70-1–EL、HSPA9–EL、NRN1–EL及其apo形式进行100 ns MD。ACTN4片段平均蛋白RMSD最低（0.163 ± 0.021 nm），BDNF全前体模型最高（2.125 ± 0.388 nm）。与apo比较，HSP70-1、HSPA9和NRN1的EL结合形式平均RMSD低于相应apo，而ACTN4和BDNF的apo形式RMSD较低。RMSF方面，ACTN4–EL、HSP70-1–EL和NRN1–EL低于相应apo；BDNF–apo和HSPA9–apo低于其EL结合形式。所有五个靶标的EL结合形式平均Rg和SASA均高于相应apo。蛋白–配体氢键呈间歇性，NRN1–EL平均氢键计数最高（0.575 ± 0.501），其次为BDNF–EL、HSP70-1–EL、HSPA9–EL和ACTN4–EL。

3.5 主成分与自由能景观分析：通过PCA及二维、三维FEL比较apo与EL结合形式所采样构象状态。NRN1–EL显示显著低能区，BDNF–EL和HSPA9–EL也显示可识别低能区但分布更宽；NRN1–EL景观提示模拟期间优先采样一个主导构象区域。FEL结果与RMSD、RMSF、Rg、SASA、氢键和MM/GBSA结果共同解释系统构象行为。

3.6 MM/GBSA结合能估计与逐残基能量分解：gmx_MMPBSA估计平均总MM/GBSA结合能，NRN1–EL最负（?39.21 ± 3.24 kcal mol^?1），其次为HSPA9–EL（?37.93 ± 2.60）、BDNF–EL（?33.83 ± 3.49）、HSP70-1–EL（?23.20 ± 5.24）和ACTN4–EL（?8.03 ± 2.15）。因未包括熵贡献且来自单条MD轨迹，这些值仅作比较性计算估计，不构成绝对实验结合自由能；NRN1–EL与HSPA9–EL估计相近，未据此建立严格定量排序。逐残基能量分解显示BDNF–EL中LEU70、LEU109、TYR113，HSP70-1–EL中VAL19、TYR21、ILE33、MET36，HSPA9–EL中MET70、VAL190、ALA225、LEU228，NRN1–EL中PHE38、LEU94、LEU107、PHE108具有较明显有利贡献；ACTN4–EL蛋白侧残基贡献相对较小。这些残基谱仅提供预测能量贡献信息，不能独立确立实验结合位点相关性。

讨论部分总结：不同计算分析未产生完全一致的靶标排序。HSPA9–EL对接分数最有利，而NRN1–EL显示最负MM/GBSA估计、最高平均蛋白–配体氢键计数及FEL中显著低能区；NRN1–EL平均RMSD和RMSF低于apo NRN1，但Rg和SASA较高。综合结果将NRN1优先为整体最有前景的计算候选物；HSPA9虽有最有利对接分数和相近有利MM/GBSA估计，但接近的MM/GBSA值未单独用于两者排序。NRN1与认知韧性和神经元可塑性相关，HSPA9为参与蛋白折叠和细胞应激反应的线粒体伴侣，但预测的EL–NRN1和EL–HSPA9相互作用不确立对这些生物功能的调节，需实验确认。ADMET预测提示EL高亲脂性和有限水溶性，可能给制剂和生物利用度带来挑战；部分渗透性输出数值较高，但不足以对口服生物利用度、CNS暴露或安全性作确定性结论，仍需实验评估溶解度、渗透性、系统暴露和安全性。局限性包括：蛋白输入结构来源和序列覆盖不同，限制跨靶标绝对比较；对接在预测结合区进行，无实验结合位点验证或redocking对照；CPLX1–EL未进入MD，动态行为未知；apo模拟提供参考但每个系统仅单条100 ns轨迹且无独立重复；MM/GBSA未包括熵贡献，对构象采样和结构模型敏感；逐残基能量分解为预测能量贡献而非实验证据。需实验结合研究和功能细胞实验验证预测的EL–NRN1与EL–HSPA9相互作用及其生物学相关性。

研究结论翻译：整合对接、100 ns分子动力学、自由能景观和MM/GBSA结果，在受检复合物中将NRN1–EL优先用于实验随访。基于整合发现，NRN1成为整体最有前景的计算候选物，显示最负MM/GBSA估计、最高平均氢键计数和显著低能构象区域。HSPA9显示最有利对接分数和相近有利MM/GBSA估计；然而综合考虑结果时，这些发现不足以优先于NRN1。与相应apo轨迹比较显示靶标依赖性变化，NRN1–EL平均RMSD和RMSF低于apo NRN1，尽管其Rg和SASA值较高。这些发现支持进一步实验评估预测的EL–NRN1相互作用，并应解释为产生假设的计算预测，直至实验验证。