慢性硬膜下血肿成人肠道菌群组成与结构改变：一项基于16S rRNA基因测序的病例对照研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Altered gut microbiota composition in adults with chronic subdural hematoma: a case-control study

　　

慢性硬膜下血肿（CSDH）日益被认为是一种动态的炎症性和血管生成性疾病，但其是否与肠道菌群改变相关仍不清楚。因此，研究人员对成人CSDH患者和健康对照（HCs）的肠道微生物谱进行了表征。方法：研究人员开展了一项观察性病例对照研究，纳入40例成人CSDH患者和96名HCs。通过16S rRNA基因测序分析粪便细菌群落。研究人员评估了α多样性和β多样性，使用协变量校正的中心对数比（CLR）模型并结合错误发现率（FDR）校正识别差异丰度菌属，使用随机森林分类器结合重复嵌套交叉验证评估属水平判别能力，并使用偏Spearman相关分析检查与临床特征的关联。结果：协变量校正后，没有明确证据表明α多样性存在差异。群落结构在Bray-Curtis、加权UniFrac和非加权UniFrac距离上均存在差异（均P = 0.001），其中加权UniFrac解释方差最大（R² = 0.106）。校正和多重检验校正后，13个菌属仍显著，包括额外校正糖尿病和记录的药物暴露的敏感性分析。Collinsella和Dorea在CSDH中丰度更高，而Bacteroides在HCs中丰度更高。在10次重复外部交叉验证划分中，折外受试者工作特征曲线下面积（AUC）均值为0.938 ± 0.010；平均参与者水平折外概率得到的AUC为0.951。错误发现率校正后，Dorea与糖尿病呈正相关，Bacteroides与脑梗死呈负相关。结论：成人CSDH患者显示肠道微生物群落结构和属水平组成存在差异，但没有明确证据表明α多样性存在差异。这些是在选定病例对照样本中的探索性关联。横断面、单中心设计妨碍因果推断，且该分类器尚未建立校准、外部有效性或临床实用性。

慢性硬膜下血肿（chronic subdural hematoma, CSDH）是一种主要影响老年人的常见神经外科疾病，在70岁及以上人群中发病率估计可达58/100,000人年，随着人口老龄化及抗血栓药物使用增加，其临床和医疗负担预计上升。CSDH曾被视为静态血液聚集，现被理解为动态的炎症和血管生成过程，局部炎症、脆弱新生血管、纤溶亢进和反复微出血可能参与血肿扩大与复发，但与该炎症过程相关的系统性因素仍不清楚。肠道菌群参与免疫稳态和代谢，并通过免疫、神经、内分泌和代谢通路与神经系统双向交流；实验研究提示肠道微生物扰动可改变脑缺血后的免疫反应和结局，人类烟雾病、轻度认知障碍及偏头痛伴肠易激综合征的病例对照研究也报道了菌群改变，但不同人群和分析流程间结果不一，CSDH成人肠道菌群尚未被系统表征。因此，研究人员开展观察性病例对照研究，比较CSDH患者与健康对照（healthy controls, HCs）的微生物多样性和分类组成，识别协变量校正后的差异菌属，评估属水平谱的内部判别能力并检查其与临床特征的关联；该横断面研究旨在识别与CSDH相关的微生物特征，而非确立因果关系。研究纳入北京天坛医院神经外科40例成人CSDH患者和96名常规健康体检HCs，CSDH依据临床表现及头颅计算机断层扫描或脑磁共振成像显示低密度或等密度硬膜下集合诊断，对照无CSDH证据；纳入年龄>18岁、可提供粪便样本且无自身免疫或胃肠道疾病者，排除近3个月使用系统性激素、中药、抗生素、益生菌或益生元者，以及粪便采样前3个月使用非甾体抗炎药者和妊娠或哺乳者。研究记录血肿体积、中线移位、血肿内部结构及180天术后复发。粪便样本采用标准化前分析流程，CSDH患者于入院次晨空腹、钻孔引流前采集，样本-20 °C保存并于24 h内-20 °C转运，随后-80 °C保存至DNA提取。关键技术方法概括（不超过250字）：研究为单中心观察性病例对照研究，样本来源于北京天坛医院，包括40例CSDH和96名HCs；采用16S rRNA基因V3–V4区扩增子测序，97%相似度聚类操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs）并基于SILVA数据库注释；以Chao1、Shannon和Simpson指数评估α多样性，以Bray-Curtis、加权UniFrac和非加权UniFrac距离评估β多样性并行主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA），采用校正年龄、性别、高血压、当前吸烟和饮酒的偏置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA）；采用CLR模型结合Benjamini-Hochberg（BH）校正识别差异菌属，并进行加糖尿病、加药物及非稀释计数敏感性分析；采用随机森林嵌套交叉验证评估属水平判别，采用偏Spearman相关分析临床关联。
研究结果如下。临床特征：分析纳入136名参与者，CSDH组中位年龄69.5岁（四分位距61.8–76.0），HC组68.0岁（62.0–73.0），P = 0.475；CSDH组男性比例更高（90.0% vs. 75.0%，P = 0.049）、糖尿病比例更高（20.0% vs. 7.3%，P = 0.039）、当前吸烟比例更低（30.0% vs. 50.0%，P = 0.032），他汀、抗凝药和抗血小板药暴露在组间无显著差异；CSDH患者中位总血肿体积111.77 mL（82.36–127.53），中位中线移位8.77 mm（4.82–11.23），内部结构均质18例（45.0%）、层状2例（5.0%）、分离4例（10.0%）、小梁15例（37.5%），1例（2.5%）两侧类型不同，1例（2.5%）180天内术后复发。测序质控显示保留序列中位数86,665（范围46,530–139,003），Good’s coverage中位数0.999（0.998–1.000），组间保留序列数和覆盖度无明确差异。α和β多样性：校正年龄、性别、高血压、当前吸烟和饮酒后，α多样性无明确组间差异，Chao1的CSDH-HC校正系数为27.043（95% CI，-4.515至58.602；P = 0.092），Shannon为0.168（95% CI，-0.197至0.533；P = 0.365），Simpson为-0.001（95% CI，-0.040至0.038；P = 0.958）；β多样性在三种距离上均存在差异，Bray-Curtis伪F = 5.029、R² = 0.036、P = 0.001，加权UniFrac伪F = 16.297、R² = 0.106、P = 0.001，非加权UniFrac伪F = 4.009、R² = 0.029、P = 0.001，且PERMDISP未发现组间离散度差异证据；校正组项分别解释Bray-Curtis、加权UniFrac和非加权UniFrac总变异的3.6%、10.6%和2.9%。分类学改变：线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size, LEfSe）识别20个跨分类阶元判别特征，属水平上Bacteroides在HC组富集，Collinsella、Blautia和Escherichia-Shigella在CSDH组富集；协变量校正后Bacteroides、Collinsella和Blautia仍显著，Escherichia-Shigella不显著。344个检测属中71个符合预设流行率和平均丰度阈值，其中13个在校正和BH校正后显著；CSDH组丰度更高的9属为Dorea、Collinsella、Erysipelotrichaceae UCG-003、Blautia、Eubacterium hallii group、Ruminococcus torques group、Romboutsia、Clostridium sensu stricto 1和Christensenellaceae R-7 group，HC组丰度更高的4属为Bacteroides、Flavonifractor、Lachnoclostridium和Lachnospira；Collinsella正校正CLR系数最大（3.134；95% CI，2.009–4.259；q < 0.001），Dorea次之（2.251；95% CI，1.494–3.009；q < 0.001），Bacteroides负系数最大（-1.988；95% CI，-2.504至-1.472；q < 0.001）。额外校正糖尿病、进一步校正他汀/抗凝/抗血小板暴露后，13个主要关联均保持方向和显著性（均q < 0.05）；非稀释计数分析保留全部13个关联并额外识别Olsenella；探索性bootstrap分析中原始13属的点位百分位区间在三种模型中均排除零。随机森林分类器与内部验证：10次外部交叉验证重复中，平均折外AUC为0.938 ± 0.010（范围0.919–0.947），平均每名参与者10次折外概率后聚合AUC为0.951；外部模型选择属的中位数为20（四分位距10–30），Bacteroides、Lachnospira和Collinsella在全部50个外部模型中被选择，Romboutsia、Eubacterium eligens group和Dorea分别在选择模型的94%、94%和90%中出现；这些估计量化重采样下的内部判别，不构成外部验证。肠道菌群与临床特征相关：130个属-临床特征配对中，校正疾病组、年龄和性别并多重检验后2个关联显著，Dorea丰度与糖尿病正相关（偏Spearman r = 0.334；95% CI，0.173–0.477；P < 0.001；q = 0.011），Bacteroides丰度与脑梗死负相关（r = -0.292；95% CI，-0.441至-0.129；P < 0.001；q = 0.041）；校正与未校正系数的Spearman相关系数为0.818，方向一致率78.5%，中位绝对变化0.039。讨论部分总结：该病例对照研究发现CSDH成人与HCs存在肠道微生物组成差异，三种β多样性距离均显示群落结构差异，而α多样性估计无明确组间差异证据；13个菌属在校正和多重检验后与CSDH相关，并在额外校正糖尿病、记录药物暴露及非稀释计数分析中保持方向和显著性。α多样性估计仍不确定，Chao1区间允许丰富度明显增加，Shannon区间允许双向差异，且未定义生物学等效界值；β多样性中校正组项仅解释Bray-Curtis、加权UniFrac和非加权UniFrac总变异的3.6%、10.6%和2.9%，多数变异不能归因于疾病组，加权UniFrac较大估计与丰度较高谱系差异相容，但不同距离效应量不可直接互换，PERMDISP未发现离散度不等证据并非组内分布相同证明。偏头痛伴肠易激综合征、轻度认知障碍和烟雾病研究提供背景而非CSDH特异性证据，招募、合并症、饮食、地理、样本处理和分析方法差异妨碍直接属水平比较或共享神经标志推断。炎症和血管生成与CSDH生物学相关，但16S rRNA测序分类谱不测量微生物功能基因、代谢通路、代谢物、肠道通透性或循环免疫介质，属内物种和菌株功能可能不同，相对丰度不测绝对细菌载量，因此不能从属水平发现推断代谢产物、炎症活性或血肿膜效应。随机森林模型在内部重采样下区分采样组，重复特征选择提示该重采样流程内一致性而非外部有效性；嵌套交叉验证限制特征选择和调参偏倚，但不能校正招募差异或确立疾病特异性，AUC衡量排序判别而非校准或临床用处，病例对照采样比例不反映临床患病率，未进行校准分析或外部验证，诊断使用前需独立评估锁定模型、校准和临床效用。糖尿病校正使Dorea的CSDH系数由2.251降至2.054，进一步药物校正为2.029，关联持续不排除残余代谢或治疗混杂；Dorea-糖尿病和Bacteroides-脑梗死相关在全队列估计而非仅CSDH病例，共享暴露、反向因果和医疗差异仍为替代解释；非稀释分析保留13个主要属关联并额外识别Olsenella，提示总体一致而非完全一致，稀释丢弃信息并可能影响低丰度特征。招募环境与疾病组不可分割：病例住院而对照参加常规体检，引流前采样限制手术影响但不排除住院、急性疾病、摄入改变或用药变化影响，一般健康、衰弱和排便习惯差异亦可贡献，饮食摄入和营养状态未系统测量，因此习惯饮食、近期摄入或营养状况差异可能贡献观察到的微生物差异且无法校正，这些限制影响分类关联和分类器判别的疾病特异性解释。单中心样本仅40例CSDH限制精度、小效应检测和推广性；药物扩展模型含10个预测变量加截距且部分药物暴露稀疏，药物记录在病例为入院前使用、对照为评估时当前使用，剂量和持续时间不可得，既往抗血栓暴露停药后仍可能相关，校正不能完全解释活性或累积暴露差异；bootstrap区间评估已选属的内部系数稳定性，不确立充分把握度或解释特征选择与多重检验不确定性，4个扩展模型bootstrap样本设计秩亏提示稀疏暴露引入的不稳定性；血肿内部结构为临床分类而非膜分隔的独立定量测量，单个粪便样本不能确定时间顺序或个体内变异，97%相似度聚类可合并DADA2等ASV方法可分辨的不同扩增序列，基于OTU来源属表的敏感性分析未检验ASV推断稳健性，这些数据不能确立物种或菌株特异性功能，需独立纵向队列评估时间和临床相关性。研究结论翻译：成人CSDH患者显示肠道微生物群落结构和属水平组成存在差异，但没有明确证据表明α多样性存在差异。主要菌属关联在额外校正糖尿病和记录药物暴露后以及非稀释敏感性分析中持续存在。这些发现仍属观察性，不确立微生物机制或诊断效用。需要开展多中心纵向研究，详细评估饮食、营养和药物，进行直接功能测量和独立分类器验证，以确定其时间和临床相关性。