《Frontiers in Oncology》：The role of microRNAs in neuroblastoma cell differentiation and their therapeutic potential: a systematic review
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神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是五岁以下儿童最常见的颅外实体肿瘤。由于神经嵴细胞（neural crest cells，NCCs）未能适时迁移和分化，NB肿瘤可沿交感链任意部位发生。尽管采用积极的多模式治疗，高危NB患者因遗传异质性、侵袭性肿
神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是五岁以下儿童最常见的颅外实体肿瘤。由于神经嵴细胞（neural crest cells，NCCs）未能适时迁移和分化，NB肿瘤可沿交感链任意部位发生。尽管采用积极的多模式治疗，高危NB患者因遗传异质性、侵袭性肿瘤生物学特性以及极难治疗的疾病复发，生存率持续处于低位。治疗NB肿瘤的策略之一是促进其向更良性的组织学表型分化。维甲酸（retinoic acid，RA）是维生素A衍生物，可降低细胞增殖并促进NB细胞向更成熟表型分化。RA常用于治疗维持期以降低NB复发风险，但遗憾的是复发率仍然较高。微小RNA（microRNAs，miRs）是调控转录后基因表达的小型非编码RNA，可在NB细胞中促进分化效应，因而代表新型治疗手段。本系统综述重点阐述已知在NB细胞分化中发挥作用的miRs，讨论其主要靶点和通路及其在NB患者治疗中的潜在作用。遵循PRISMA 2020推荐规范，研究者在Ovid MEDLINE和Embase数据库中进行系统文献检索，检索时间自建库至2023年6月。根据文章与miRs在NB分化中作用的相关性筛选纳入文献；排除未聚焦于miRs、分化或NB的文章以及非英文出版物。经摘要和全文筛选，396篇文章中共89篇符合入选标准。本综述揭示53个条目，涵盖在NB分化中发挥作用的单个miRNA及miRNA家族。miR-124、miR-34和miR-506-3p研究较为充分，可显著促进NB分化。这些miRs的失调与患者总生存期（overall survival，OS）降低相关。miR-17–92簇被发现拮抗NB分化，并与不良生存相关。临床前证据表明，miR-124、miR-34和miR-506-3p家族可促进NB细胞向更成熟表型分化，但在临床应用前仍存在实质性转化障碍。
论文主体内容总结
1 引言
神经母细胞瘤（NB）是五岁以下儿童最常见的颅外实体肿瘤，起源于胚胎神经嵴细胞（NCCs），可发生于肾上腺髓质、腹部椎旁神经节及胸部、头颈部、腹部和盆腔的交感神经节。NB根据肿瘤侵袭范围、组织学和分子特征及患者因素分为低危、中危和高危。高危患儿约占全部病例的一半，诊断时的疾病分期具有高度预后价值：低危肿瘤在婴儿中常自发消退和分化，而高危肿瘤尽管接受强化多模式治疗仍表现出侵袭性扩散、早期转移和频繁复发。低危和中危患者总生存率超过90%，而高危患者总生存率仅约40%。
肿瘤细胞分化在组织病理学和治疗策略中发挥重要作用。组织学上，NB分为未分化型（完全由神经母细胞组成，无神经节细胞成熟）、低分化型（以神经母细胞为主，成熟/成熟中神经节细胞<5%）和分化型（以神经母细胞为主，但成熟/成熟中神经节细胞>5%）。加速NB肿瘤分化过程是高危患者的治疗策略之一，可诱导恶性细胞分化为成熟细胞，导致肿瘤细胞生长停滞和凋亡。维甲酸（RA）仍是诱导NB分化最有效的药物，13-顺式RA目前是高危NB患者的标准治疗方案。然而，对RA治疗的反应存在差异，且RA治疗结束后可能无法维持。因此，深入理解NB分化机制有助于开发新的治疗策略。
高危NB肿瘤常存在节段性染色体异常，包括1p、11q、14q染色体缺失或杂合性丢失，或17q染色体获得。此外，30%的肿瘤存在MYCN扩增，这是与NB相关的最常见癌基因，也是预后不良的指标。ALK、ATRX、TP53、RAS/MAPK等基因也存在多种致癌/抑癌通路突变。微小RNA（miRs）是长度17–22个核苷酸的小型非编码RNA，通过调控转录后基因表达在细胞稳态中发挥关键作用，其重排或失调可破坏发育、分化和生长的平衡。miRs在NB肿瘤发病机制中发挥重要作用，并可能参与常见癌基因的失调。本系统综述旨在阐述参与NB细胞分化的miRs的作用并探索其治疗潜力。
2 方法
2.1 检索策略与筛选标准
按照PRISMA声明进行系统文献检索。研究纳入标准基于以下PICO问题：在神经母细胞瘤中，microRNA是否在分化中发挥作用？2023年6月，研究者在Ovid MEDLINE和Embase数据库中检索microRNA、神经母细胞瘤和细胞分化相关的关键词和受控词汇。检索阶段未设置发表日期、年龄或语言限制。排除未聚焦于miRs、分化和NB的研究以及非英文研究。MEDLINE和Embase是两个最全面的生物医学数据库，二者结合可覆盖绝大多数生物医学系统综述的相关研究。
2.2 数据提取与质量评估
所有摘要由两名研究者使用Covidence软件独立筛选，分歧由第三名独立研究者解决。去重后共获得396篇潜在相关文献，摘要筛选确定125篇进入全文筛选，全文筛除36篇不符合纳入标准（18篇缺乏miRNA介导分化的直接证据，10篇为综述或非原创研究，8篇为非英文或已撤稿），最终89篇纳入数据提取。由于目前尚无适用于体外研究的经过验证的偏倚风险评估工具，研究者采用基于GRADE框架的定性方法评估纳入研究的内部有效性，包括对照设置、实验重复、细胞系鉴定和跨独立实验室结果一致性。每个miR条目依据跨独立研究的重复性和实验验证广度进行质量评级（高/中/低）。
3 结果
在纳入的89篇研究中，共描述了53个在NB分化中发挥作用的miRs。研究确定了4个对NB分化具有显著影响的主要miR或miR家族，选择标准包括：独立研究数量最多（各≥5项）、具备功能获得和功能丧失的验证数据、具有临床相关性以及同时涵盖促分化和抗分化机制。
3.1 miR-124家族
miR-124由三个基因组位点编码，在神经组织中高表达，调控神经发生、神经元分化和突触功能。在RA诱导分化后的NB细胞中表达上调，异位表达miR-124可使NB细胞形态从球形未分化状态转变为具有延伸神经突的成熟神经元网络形态，并增加β-微管蛋白III、MAP2、SYN、NF-M和Nestin等神经元分化标志物的表达。机制方面，PTBP1与Pri-miR-124-1结合抑制其成熟为miR-124从而阻断神经元分化；分化过程中Pri-miR-124-2水平升高，其成熟为miR-124后可抑制PTBP1，促进神经元分化。miR-124还通过下调EZH2（组蛋白H3 Lys-27甲基转移酶）发挥表观遗传调控作用。此外，miR-124通过下调CDK4、CDK6、STAT3、E2F3和BCL2调控分化和细胞周期，抑制维甲酸受体γ（RARG），并抑制维持NB未分化状态的转录因子ELF4。miR-124-3p还与miR-34a-5p、miR-34b-5p、miR-506-3p、miR-449a、miR-449b-5p、miR-103a-3p和miR-2110形成网络协同抑制MYCN表达。临床相关性方面，miR-124家族低表达与高危NB患者总生存期差相关，高表达可降低NB细胞活力、改变细胞形态、阻滞细胞周期并诱导凋亡。体外实验显示miR-124可逆转NB细胞对顺铂的耐药性。
3.2 miR-34家族
miR-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c组成，在多种肿瘤模型中具有抑癌特性。在NB中，该家族通过抑制BCL2和MYCN等多种细胞周期和分化调节因子，参与神经元分化、突触形成和细胞增殖调控。p53家族成员TAp73可诱导分化NB细胞中miR-34a的表达，抑制miR-34a或TAp73可减少RA诱导分化过程中的神经突生长。miR-34a可拮抗E2F3并降低survivin、Cyclin D3和C-MYC水平，从而阻止细胞增殖并促进分化。miR-34a通过靶向MYCN 3'UTR直接抑制MYCN，还靶向聚合酶I转录释放因子和vimentin，参与上皮-间质转化和RNA转录调控。miR-34a还靶向LYAR和CTCF促进其mRNA降解以诱导分化。miR-34b和miR-34c通过靶向CCNE2和E2F3等细胞周期调节因子诱导G1期阻滞，促进神经元成熟；miR-34c还靶向MYCN和BCL2。临床相关性方面，高危NB肿瘤中miR-34a表达水平较低，miR-34b和miR-34c水平升高与高危NB患者预后改善相关。
3.3 miR-506-3p
miR-506-3p具有强效的NB细胞分化诱导作用，可增加βIII-微管蛋白、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和生长相关蛋白43（GAP43）等分化因子，并呈剂量依赖性地促进神经突生长。其机制主要通过下调MYCN癌基因实现：miR-506-3p调控多形性腺瘤基因样2（PLAGL2），后者可促进MYCN转录。PLAGL2敲低可诱导分化、降低细胞增殖和存活，增加神经元分化标志物表达，同时降低增殖标志物PCNA和Ki67并增加凋亡标志物裂解型PARP。miR-506-3p还下调CDK4和STAT3，二者联合抑制可产生比单独抑制更显著的神经突生长。临床相关性方面，MYCN扩增肿瘤中miR-506-3p水平缺失，其低表达与患儿预后差相关。值得注意的是，截短的miR-506-3p类似物（缺失至多两个核苷酸）仍保留分化诱导活性，可能降低制造成本和非特异性毒性。
3.4 miR-17–92簇
miR-17–92簇（包括miR-17、miR-18、miR-19、miR-20和miR-92）从单一基因组位点作为多顺反子单元转录，已知抑制NB肿瘤分化，促进肿瘤发生并导致更差预后。该簇受MYCN调控，直接抑制参与分化的基因，特别是核激素受体（NHRs）如糖皮质激素受体（GR）和雌激素受体α（ERα），从而降低NB分化。ERα和GR水平降低与TrkA、p75NTR和SCG2等分化标志物低表达相关。抑制miR-17–92簇可上调BCL2、MEF2D和MAP3K12等神经元分化标志物。该簇还抑制RUNX1和RUNX3——感觉神经元谱系分化的主转录因子，直接导致分化减少和增殖促进。临床相关性方面，miR-17–92簇尤其是miR-18a在MYCN扩增肿瘤中高表达，其下游靶点GR表达与分化程度和患者总生存期改善正相关。
3.5 其他参与NB分化的miRs
除上述主要miRs外，还有其他49个miRs参与NB细胞分化。其中一组直接受p53激活诱导，包括miR-143-3p、miR-145、miR-192、miR-203a和miR-432，它们主要限制增殖并促进分化相关表型。另一组汇聚于PHOX2B——交感神经元分化的主转录因子：miR-125a、miR-494、miR-495和miR-543均靶向或与PHOX2B共调控，持续促进分化相关表型。多个miRs作用于染色质和表观遗传机制：miR-152靶向DNMT1，miR-130a-3p和miR-432靶向MeCP2，miR-137靶向组蛋白去甲基化酶KDM1A。少数miRs通过Notch信号通路发挥作用，包括miR-23a-24-27和miR-129a，均靶向Notch1促进分化。另有多个miRs汇聚于程序性细胞死亡调节因子，包括miR-125b（BAX/BCL-2）、miR-184（caspase-3/7）、miR-376a和miR-939（NFkB/Bcl-xL/FasL）以及miR-3613-3p（DFFB/APAF1）。值得注意的是，并非所有miRs均促进分化：miR-221、miR-222-3p、miR-335和miR-375通过HMGB1/PTEN信号或N-myc-Hud轴偏向非神经元或低分化神经母细胞表型。其余miRs各由单项研究支持，通过不同靶点发挥作用，包括BDNF（miR-107）、ZEB1（miR-200b）、SOX2（miR-340）、SOX4（miR-320d）以及PCNA、p27kip1、CDK5和p35（miR-1290）等细胞周期调节因子。这些发现表明NB分化受广泛且仅部分重叠的miR-靶点互作网络调控，未来基于miR的分化治疗可能受益于涵盖p53、PHOX2B、表观遗传调节因子和Notch信号等多条汇聚通路的组合策略。
4 讨论
NB是一种异质性肿瘤，高危患者预后差。MYCN、ALK、ATRX等癌基因和节段性染色体畸变在高危NB中具有重要预后作用。本综述确定的四个主要miR组在NB分化中发挥关键作用：miR-124、miR-34和miR-506-3p具有促分化效应，在高危NB肿瘤中表达不足；miR-17–92簇显著抑制NB细胞分化，在高危肿瘤中表达上调。这些miRs并非孤立发挥作用，而是形成以MYCN为核心的相互关联的调控网络。MYCN作为该网络的中心节点，miR-124-3p、miR-34a-5p、miR-34b-5p、miR-506-3p、miR-449a、miR-449b-5p、miR-103a-3p和miR-2110均汇聚抑制MYCN表达；反之，MYCN也抑制多个促分化miRs的表达，形成维持NB未分化增殖状态的相互反馈回路。功能获得和功能丧失实验证实这些miRs是分化的主动调节因子而非被动标志物：异位过表达miR-124、miR-34a和miR-506-3p可直接诱导形态学分化、上调分化标志物并下调增殖标志物；抑制这些miRs可阻断RA诱导的分化。这些发现支持miRs作为传统NB治疗补充手段的潜在治疗作用。然而，纳入研究主要基于体外结果，体内数据有限，目前尚无针对NB的miR治疗人体试验。MYCN扩增从根本上改变NB中的miRNA格局，直接上调抗分化miRs，同时抑制包括miR-124、miR-34a和miR-506-3p在内的促分化miRs。
