《Frontiers in Veterinary Science》：Effects of rifaximin on the fecal microbiota of healthy dogs: a pilot study
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引言：利福昔明是一种吸收不良的抗生素，用于治疗人类肝性脑病（hepatic encephalopathy, HE）。然而，由于抗生素可能改变肠道微生物组成，评估抗生素对肠道微生物群（gut microbiota）的影响十分重要。本研究旨在探究连续28天给予利福
引言：利福昔明是一种吸收不良的抗生素，用于治疗人类肝性脑病（hepatic encephalopathy, HE）。然而，由于抗生素可能改变肠道微生物组成，评估抗生素对肠道微生物群（gut microbiota）的影响十分重要。本研究旨在探究连续28天给予利福昔明对健康犬肠道微生物群的影响。方法：五只健康犬按25 mg/kg q12h（每12小时1次）给予利福昔明28天。分别于第0天（利福昔明给药前）、第14天和第28天经直肠采集粪便样本。通过靶向V3–V4区的16S rRNA基因测序，在三个时间点评估粪便微生物群组成和多样性。结果：给药期间未观察到不良效应，包括胃肠道症状。在所有时间点，Firmicutes为最丰富门，Fusobacteriota、Bacteroidota和Actinobacteriota亦为主要门。α多样性（alpha diversity）指标未见显著变化，包括扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASVs）（p=0.449）、Chao1（p=0.241）和Shannon指数（p=0.248）；β多样性（beta diversity）指标亦未见显著变化，包括加权UniFrac距离（weighted UniFrac distances）（p=0.471）、非加权UniFrac距离（unweighted UniFrac distances）（p=0.157）和Bray–Curtis相异度（Bray–Curtis dissimilarities）（p=0.089）。结论：给予利福昔明28天后，未检测到粪便微生物群α或β多样性的统计学显著变化。鉴于样本量小且缺乏未治疗对照组，这些发现应解释为初步结果，不能为犬利福昔明的临床使用提供证据。
论文解读：利福昔明28天给药对健康犬粪便微生物群的影响
肠–肝轴（gut–liver axis）是胃肠道与肝脏之间的双向关系，由多因素复杂相互作用形成。肠道黏膜屏障作为解剖学过滤系统，清除肠源性毒素和微生物组分，残余毒素经门静脉运输至肝脏解毒；肝脏则向十二指肠分泌胆汁酸和抗体，通过抑制小肠细菌过度生长（small intestinal bacterial overgrowth, SIBO）和抑制细菌黏附于上皮，帮助维持黏膜稳态。肝性脑病（hepatic encephalopathy, HE）主要是由肠道细菌产生的氨引起的神经性疾病；在人类中，生物信息学和微生物组研究进展显示HE患者存在生态失调（dysbiosis），即有益肠道细菌减少和有害细菌过度生长。生态失调可通过升高内毒素水平和损伤肠道黏膜屏障加重HE，因此适当调节肠道微生物群被认为是人类HE治疗的重要策略。利福昔明是源自利福霉素的半合成抗生素，对肠道革兰阳性和革兰阴性细菌具有广谱活性，胃肠道吸收率极低，全身吸收据报道低于0.4%。因此，利福昔明传统上作为肠道靶向抗生素用于人类多种胃肠道疾病，并已被美国食品药品监督管理局批准用于降低显性HE患者复发风险。与许多抗生素不同，多项研究显示利福昔明的作用 largely 限于特定病原体，对健康肠道微生物群影响最小。在兽医领域，HE采用限蛋白饮食、乳果糖和抗生素（如甲硝唑）的多模式管理；但抗生素治疗HE的疗效尚不明确，且因潜在不良效应和抗菌耐药而不鼓励使用。Serrano et al. 在先天性肝外门体分流（congenital extrahepatic portosystemic shunts, EHPSS）犬中未观察到甲硝唑的额外获益，提示肝支持饮食联合乳果糖足以用于EHPSS犬术前内科管理；Favier et al. 报道未手术且接受限蛋白饮食或乳果糖内科管理的先天性门体分流（congenital portosystemic shunts, CPSS）犬估计中位生存时间为3.2年，但生存时间从长期存活者到相对短期内死亡者不等。因此，饮食管理和乳果糖对许多犬的HE控制有效，但在部分病例中可能不足，需要额外治疗选择。人类HE中利福昔明联合乳果糖已显示较高临床疗效，可能有益于犬HE管理。然而，许多抗生素可能不利影响肠道微生物群多样性和组成，破坏肠–肝轴稳态；甲硝唑可诱导健康犬肠道微生物群可逆性改变。在此背景下，利福昔明具有在提供HE治疗获益的同时保留肠道微生物群的潜力。因此，这项先导研究旨在描述健康犬给予利福昔明前及28天给药期间的粪便微生物群特征，作为未来犬临床人群对照研究的初步信息。
研究人员开展了一项探索性先导研究：五只健康实验室比格犬（2只雄性、3只雌性）接受利福昔明25 mg/kg q12h口服28天，并在D0、D14、D28采集粪便，采用16S rRNA基因测序评估粪便微生物群组成和α/β多样性。研究得出，给药期间未见不良反应，门水平组成维持，α和β多样性指标均未检测到统计学显著变化。据研究人员所知，该研究首次评估利福昔明对犬粪便微生物群的影响；但鉴于样本量小且无未治疗对照组，结果应视为初步，不能为犬利福昔明临床使用提供证据。
关键技术方法：研究纳入5只健康实验室比格犬（2雄3雌，中位年龄9岁[范围8–11岁]，体重11.2 kg[范围10.3–14.4 kg]），均来自研究人员所在大学附属单一设施；给药前1个月至研究期间统一饲喂同一商品化干粮，前6个月未使用抗生素、驱虫药或止泻药。利福昔明按25 mg/kg q12h口服28天。D0、D14、D28经直肠采集粪样。采用16S rRNA基因V3–V4区测序，QIIME 2与DADA2去噪，SILVA 138分类；计算α多样性（ASVs、Chao1、Shannon指数）和β多样性（加权/非加权UniFrac距离、Bray–Curtis相异度），以主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA）可视化；统计采用Friedman检验、置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA）和多元离散度置换分析（permutational analysis of multivariate dispersions, PERMDISP），重复测量中限制置换于犬内。
3.1 粪便微生物群组成
通过分类学分析显示，D0、D14、D28门水平粪便微生物群主要由四个门组成；Firmicutes为最优势门，Fusobacteriota、Bacteroidota和Actinobacteriota亦为主要门。该组成在整个研究期间维持，未观察到明显变化。
3.2 粪便微生物群多样性
通过16S rRNA测序和多样性分析显示，质量过滤和去噪后每样本reads数为28,093–54,880，中位37,828；研究人员生成α稀疏曲线并据结果进行样本归一化。α多样性方面，ASVs（p=0.449）和Chao1（p=0.241）在D14和D28较D0呈下降趋势；Shannon指数（p=0.248）在D14较D0呈下降趋势，但在D28与D14相比保持相似水平；Friedman检验显示D0、D14、D28间各α多样性指标均无显著变化。β多样性方面，基于加权UniFrac距离、非加权UniFrac距离和Bray–Curtis相异度的PCoA未见D0、D14、D28样本明显聚类；PERMANOVA显示加权UniFrac距离（p=0.471）、非加权UniFrac距离（p=0.157）和Bray–Curtis相异度（p=0.089）均无显著差异；PERMDISP分析显示各组多变量离散度无显著差异，加权UniFrac距离p=0.991、非加权UniFrac距离p=0.363、Bray–Curtis相异度p=0.317。
讨论部分总结：该小样本先导研究旨在描述健康犬利福昔明28天给药前后的粪便微生物群，作为未来犬临床人群对照研究的初步信息；据研究人员所知，该研究首次评估利福昔明对犬粪便微生物群的影响。研究期间未观察到门水平组成或α/β多样性的统计学可检测变化。许多抗生素可直接影正常肠道细菌并导致抗生素诱导的生态失调；在犬中，甲硝唑、泰乐菌素、阿莫西林-克拉维酸等与微生物群多样性降低、生态失调指数升高或可逆性改变有关。与上述其他抗生素研究不同，本研究未检测到利福昔明给药期间粪便微生物群多样性的统计学显著变化；但由于未设对照抗生素或安慰剂组，不能与其他抗生素直接比较。利福昔明在人类中用于HE、旅行者腹泻、肠易激综合征（irritable bowel syndrome, IBS）和SIBO等，并报道在发挥临床疗效时保留肠道微生物群多样性；其抗菌作用通过抑制细菌DNA依赖性RNA聚合酶，抑制细菌RNA合成。人类8周利福昔明研究未发现肠道微生物群丰度变化，但相关网络分析显示细菌与代谢物之间连接减少；12周HE和肝硬化研究提示利福昔明维持肠道微生物群总体多样性，但诱导特定菌株替换和基因组突变，改变某些细菌代谢途径。本研究未评估较低分类水平或微生物群功能改变，因此利福昔明是否影响微生物群功能尚不清楚。另一个因素是靶细菌选择性；本研究中Firmicutes在给药前为优势门，Fusobacteriota、Bacteroidota和Actinobacteriota亦为主要门，且28天给药后保持稳定，这与既往健康犬肠道微生物群研究一致。人类HE研究中利福昔明靶向种水平病原类群，如Ruminococcus gnavus和Streptococcus salivarius；IBS研究显示利福昔明改善临床体征而不改变门水平肠道微生物群组成，但调节有限数量的低丰度细菌种；利福昔明还可促进Bifidobacterium等有益菌生长。由于本研究分析限于门水平组成，不能得出较低分类水平或低丰度细菌群变化的结论；未来需采用宏基因组学（metagenomics）和代谢组学（metabolomics）评估利福昔明给药后较低分类水平和功能变化。本研究中28天利福昔明疗程在所有犬中耐受良好；但该先导研究并非为确定利福昔明在犬中的安全性、最佳剂量或临床疗效，剂量基于既往评估慢性肠病（chronic enteropathy）犬临床疗效的研究，剂量变化可能对健康犬肠道微生物群产生不同影响。研究限制包括：样本量小且缺乏未治疗对照组，限制统计效能并增加II类错误（type II error）可能；本研究为探索性自身对照先导研究，未设安慰剂或对照抗生素组，限制因果推断并妨碍利福昔明与其他抗生素直接比较，因此无统计学显著差异不应解释为利福昔明对粪便微生物群无影响；实验犬在饮食、饲养设施、年龄和品种方面均一，这些因素可影响肠道微生物群，标准化可能引入微生物群特征偏倚；需更大规模安慰剂对照研究评估利福昔明对犬粪便微生物群的影响、考虑个体间差异并确定不同条件下能否获得相似结果。实验期相对较短；CPSS是犬HE最常见原因，术前内科管理推荐至少14天稳定期，而肝硬化等慢性肝病需数月到数年长期管理，治疗时长可能对肠道微生物群产生不同影响。研究未评估抗菌耐药基因表达，肠道微生物群无变化是否受细菌获得抗菌耐药基因影响尚不清楚；但人类中利福昔明耐药基因出现罕见。粪样于?20 °C而非?80 °C保存，尽管所有样本处理条件相同，该保存条件可能影响某些细菌类群恢复。
研究结论翻译：在这项五只健康实验室犬的探索性先导研究中，28天利福昔明给药期间未检测到粪便微生物群α或β多样性的统计学显著变化。由于样本量小、缺乏未治疗对照组以及16S rRNA基因测序的分类和功能分辨率有限，这些发现应解释为初步结果。因此，当前微生物组数据不能为犬利福昔明的临床使用提供证据。未来需要大规模安慰剂对照研究，并结合宏基因组学和代谢组学。
