《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Plant-derived extracellular vesicles for intestinal mucosal repair: mechanisms, microbiota-host interactions, and bioengineered delivery
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植物源细胞外囊泡（PDEVs）及相关纳米颗粒制剂正被研究用于肠黏膜修复。多数治疗性证据涉及植物组织破碎后分离得到的异质性类外泌体纳米颗粒（ELNs）；因此，本综述区分了胞外释放的囊泡、来源未明确的组织来源纳米颗粒制剂以及重构型载体。基于基础性可食用植物纳米囊泡
植物源细胞外囊泡（PDEVs）及相关纳米颗粒制剂正被研究用于肠黏膜修复。多数治疗性证据涉及植物组织破碎后分离得到的异质性类外泌体纳米颗粒（ELNs）；因此，本综述区分了胞外释放的囊泡、来源未明确的组织来源纳米颗粒制剂以及重构型载体。基于基础性可食用植物纳米囊泡研究，研究人员整合了炎症控制、结构修复、再生活性和功能性屏障恢复方面的临床前证据。报道的作用包括调节巨噬细胞活性、炎症小体信号传导和黏膜免疫应答，减少中性粒细胞相关性损伤，提供上皮保护，以及改善紧密连接和黏液相关屏障特征。在部分研究中，肠道干细胞反应和类器官形成支持了再生活性，但持久的再生仍未得到充分证实。植物源RNA被肠道微生物摄取，以及涉及色氨酸衍生物和短链脂肪酸的代谢中继，将特定制剂与微生物群-宿主通讯联系起来。工程化策略支持药物和核酸递送、胃肠道保护、局部结肠暴露和细胞摄取。证据仍主要来自临床前研究，在制剂特性鉴定、批次一致性、活性货物的因果验证、剂量-暴露-效应关系、安全性及规模化生产方面存在空白。向临床转化需要针对特定制剂的表征和可重复的效力测定方法，并结合对黏膜结构、再生、屏障功能和持久性的综合评估。
1 引言
肠黏膜稳态依赖于肠上皮细胞（IECs）、细胞间连接、黏液、抗菌分子、黏膜免疫、肠道干细胞（ISCs）及肠道微生物群的协同相互作用。屏障破坏使微生物得以进入黏膜免疫区室，引发炎症、氧化应激和中性粒细胞相关性损伤，进而进一步损害上皮和干细胞微环境。这些过程发生于炎症性肠病（IBD）及其他形式的肠道损伤中。屏障完整性、上皮再生及微生物群-免疫稳态的持续性缺陷可能影响疾病控制和长期预后。
肠道疾病的治疗目标已超越症状控制和炎症抑制，转向黏膜愈合。新兴疗法应分别从炎症控制、结构修复、再生活性和功能性屏障恢复四个方面进行评估。炎症减轻可能与持续性通透性缺陷或上皮更新不足并存，这支持将免疫调节与组织修复相结合的策略。
黏膜愈合的临床评估结合了疾病特异性内镜、症状和生物标志物，这些指标提供互补信息，不应被视为可互换的终点。溃疡性结肠炎中使用Mayo内镜子评分（MES）和溃疡性结肠炎内镜严重程度指数（UCEIS），而克罗恩病的简单内镜评分（SES-CD）用于评估内镜下疾病活动度。粪便钙卫蛋白和C反应蛋白支持监测，但生物标志物正常化本身并不确立内镜下愈合。STRIDE-II将内镜下愈合确定为长期治疗目标；溃疡性结肠炎的组织学愈合和克罗恩病的透壁愈合提供了缓解深度的额外衡量标准，而非普遍正式的治疗目标。实验性修复评估同样应区分紧密连接蛋白、黏液和隐窝结构、上皮/ISC反应及类器官形成，以及跨上皮电阻（TEER）、肠道通透性和微生物易位等功能性指标。整合这些互补性终点有助于将实验机制与临床上有意义的恢复及以患者为中心的治疗目标联系起来。
植物源性囊泡制剂可能兼具局部生物活性和胃肠道递送能力，尽管稳定性和靶向性取决于具体制剂。黄戈张及其同事在葡萄、葡萄柚和西兰花方面的开创性研究确立了ISC反应、巨噬细胞靶向及树突状细胞（DC）AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号传导等相互关联的研究方向。张明真、Didier Merlin及其同事的生姜研究补充证明了抗炎和上皮保护活性。这些贡献支撑了后续关于功能性货物和工程化递送的研究；其历史发展在2.1节和表1中进行了总结。
本综述考察了植物源细胞外囊泡（PDEVs）、相关类外泌体纳米颗粒（ELNs）、植物源纳米颗粒（PDNP）制剂及工程化载体，因为这些材料构成了大部分肠道治疗文献的基础。保留原始研究名称，但纳入并不确立胞外生物发生，也不证明将组织来源颗粒或重构载体的效应归因于真正的PDEV是合理的。
现有综述已涉及肠道稳态、微生物群调控及植物源药物递送。在此，研究人员考察了免疫调节、上皮保护、ISC相关应答、微生物群-宿主互作及工程化手段如何促进黏膜修复。研究人员根据所测定的终点区分疾病改善、炎症控制、结构修复、再生活性和功能恢复，并确定了可重复转化的必要条件。
2 植物源细胞外囊泡及相关纳米颗粒制剂的生物学特征
2.1 历史发展、定义、命名及来源
2.1.1 历史背景与可食用植物源纳米囊泡研究的里程碑
1967年，Halperin和Jensen描述了胡萝卜悬浮培养细胞中多泡体与质膜融合并将其内容物释放到细胞壁空间的现象。这些观察结果为研究植物细胞外囊泡提供了早期结构基础，而可食用植物源制剂的治疗应用则在数十年后才被探索。2013年的早期治疗文献确立了葡萄衍生ELNs调节Lgr5+肠道干细胞反应和类器官形成，以及Wang等人将葡萄柚衍生脂质重组为工程化纳米载体用于治疗递送这两个相互关联的方向。2014年，葡萄柚纳米囊泡结合了固有肠道巨噬细胞靶向、HO-1诱导、抗炎作用和甲氨蝶呤递送。随后的生姜研究（2016年）证明了上皮保护作用，而西兰花研究（2017年）则确立了DC相关的免疫调节。2018年，Teng等人证明了植物源ELNs被肠道微生物摄取以及RNA介导的细菌基因表达和色氨酸代谢变化。这些研究共同将可食用植物纳米囊泡研究从上皮和免疫细胞反应扩展到工程化递送及微生物群-宿主通讯。
2.1.2 定义与术语
细胞外囊泡（EVs）通常定义为由细胞释放并由脂质双层包裹的非复制性颗粒。MISEV2023强调，在缺乏相应生物发生途径的确凿证据时，应谨慎使用“外泌体”等生物发生特异性术语，这一原则尤其适用于起源和生物发生尚未完全阐明的植物源纳米颗粒。一个关键区别在于真正的植物细胞外囊泡（PEVs，亦称PDEVs）与类外泌体纳米颗粒（ELNs）之间。许多被描述为ELNs、植物源纳米颗粒（PDNPs）或相关颗粒的制剂实际上来源于榨汁、匀浆或机械破碎植物组织。其分离过程并未确立胞外生物发生；它们可能含有胞外和胞内囊泡、膜碎片、脂质-蛋白质复合物及其他纳米级成分。因此，ELNs/PDNPs与真正的PEVs不可互换。在本综述中，PDEVs和PEVs仅在该起源得到支持时才指代胞外释放的囊泡；这两个缩写均不作为所有植物纳米颗粒的总称。“植物源性囊泡制剂”这一描述性短语统指本文所回顾的相关制剂，而不为其赋予共同的生物发生。原始研究名称，包括ELNs、GDNPs、GDNs、EVLPs及研究特定的EV标签，在个别出版物中予以保留。此类标签本身并不能确立胞外或内涵体起源。重构型脂质/膜载体和杂交制剂与完整的天然制剂分开识别。大量基础工作先于当前的EV指南，改进的术语不会削弱其生物学或治疗贡献。目前研究的植物来源包括葡萄、葡萄柚、生姜、西兰花、姜黄、大蒜、人参、马齿苋、芦荟、黄精、黄连、穿心莲和槐米。不同物种和组织来源的颗粒在其脂质、小RNA、蛋白质和植物化学组成上差异显著；这些差异可能进而影响稳定性、靶细胞摄取和生物活性。植物品种、成熟阶段、生长环境、收获和储存条件可能进一步引入批次间变异性。目前，尚无普遍接受的分子标记或统一标准来评估不同植物源性囊泡制剂的产品特性和质量。
2.2 与动物源EV平台的比较
与动物源EVs相比，特别是哺乳动物细胞来源的系统，植物制剂具有独特的脂质和植物化学谱系。葡萄ELNs富含磷脂酸和磷脂酰乙醇胺，生姜纳米颗粒含有磷脂酸和半乳糖脂，而葡萄柚纳米囊泡具有不同的磷脂谱。这些例子说明了来源依赖性组成，而非通用的植物膜特征。可食用生物质可提供丰富的可再生原料和有前景的颗粒产量，同时多种制剂已在临床前研究中显示出胃肠道相容性。植物来源降低了对哺乳动物供体源病原体和某些供体细胞免疫组分的担忧，但较低的免疫原性或完全免于病原体风险尚未在所有产品中得到证实。过敏原、微生物污染、农药和途径依赖性暴露仍然相关。潜在的可扩展性还取决于纯化回收率、明确的产品特性和可重复的效力；高生物质可用性并不等同于高产量已证实的细胞外囊泡。
2.3 分离与表征
最常用的富集植物源纳米囊泡的方法包括差速离心和超速离心，部分研究使用密度梯度离心以获得更高纯度。尺寸排阻色谱法、膜过滤和切向流过滤（TFF）也越来越受到关注，尤其是TFF具有可扩展性且兼容连续处理。常规表征使用透射电子显微镜观察形态，纳米颗粒追踪分析（NTA）或动态光散射（DLS）测量粒径分布，以及zeta电位测量表面电荷。这些测量单独无法确定制剂特性或纯度。需要互补的分离方法、膜完整性评估以及蛋白质组学、脂质组学、小RNA或代谢组学分析来表征囊泡和非囊泡组分。分离流程需平衡纯度、回收率、膜完整性、可重复性和可扩展性。由于处理过程会改变组分比例和生物效力，在比较研究时应将分离方法视为产品特性和功能的决定因素。
2.4 生物活性货物与功能性膜组分
植物源性囊泡制剂可含有与脂质膜相关的RNAs、蛋白质和植物化学物质。在归因生物活性时必须考虑其组成、膜完整性和非囊泡成分。生姜衍生纳米颗粒（GDNPs 2）含有磷脂酸和半乳糖脂、小RNAs、6-姜辣素和6-姜烯酚；在RAW264.7巨噬细胞中研究了其摄取和抗炎活性，而上皮效应则在Colon-26和Caco-2BBE系统及小鼠中进行。大蒜衍生类外泌体纳米囊泡（称为GENs）提供了更具针对性的证据：han-miR3630-5p被证明靶向TLR4 3'非翻译区并抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路。近年来，植物纳米囊泡研究已从组成谱分析进展到功能性货物的因果验证。源自梅的胞外囊泡样颗粒（EVLPs）破坏NEK7-NLRP3相互作用并抑制NLRP3炎症小体激活；此外，RNA降解、小RNA测序及miRNA模拟物和抑制剂实验支持miR159作为功能性货物之一的关键作用。在黄精的ELNs中，miR166u被报道靶向CD11c并与抑制TLR4/AKT/NF-κB通路相关。源自黄连的ELNs提供了将miR-5106、Slc39a2、锌稳态、NET形成、减少IEC焦亡及增加IEC/ISC增殖联系起来的机制证据。然而，值得注意的是，该研究采用腹腔注射给药；其主要贡献在于机制验证，而非有效口服递送的直接证据。除了封装货物，植物纳米囊泡的膜组分也可能在靶向和功能调控中发挥作用。因此，植物纳米囊泡的功能最好被理解为一个整合的“膜特性-生物活性货物-受体靶标”框架——其中膜脂质和表面组分影响货物稳定性、被宿主细胞或微生物的摄取以及组织分布，而RNAs和植物源小分子控制分子靶点和信号通路。未来，功能归因应越来越多地依赖因果方法，如货物耗竭、受体阻断和拯救实验，而非仅基于组学数据的关联。膜组成不应与摄取机制混淆。脂质谱分析可鉴定组分，而抑制剂、竞争、耗竭或脂质重构实验可为提出的摄取机制提供功能性证据。
2.5 胃肠道稳定性、黏膜滞留与细胞摄取
口服植物源性囊泡制剂的肠道活性取决于其生物活性成分的稳定性和局部可利用性，以及它们与靶宿主细胞或肠道微生物的相互作用。胃酸、消化酶和胆汁盐是植物源性囊泡制剂需要克服的首要障碍。其相对稳定性可能归因于膜的物理保护，这种保护可保护封装的植物化学物质和RNAs，以及特定膜脂质组成的特性；这些脂质可能有助于在酸性和消化条件下维持膜完整性和胶体稳定性。根据制剂及其作用机制的不同，与肠道黏液层的相互作用、到达靶点的途径、细胞或微生物摄取以及功能性货物释放可能有助于生物活性。不同来源的植物源性囊泡制剂在肠道中也表现出不同的细胞/微生物摄取模式。重要的是，口服植物源性囊泡制剂后在组织中检测到的任何荧光都不应必然被视为囊泡和/或货物存活并到达靶位置的证据。递送评估应区分完整颗粒到达、货物共递送和功能性靶细胞反应与组织相关荧光。报道的摄取指标不可直接互换：它们可能代表内化给药颗粒的比例、颗粒相关标签阳性细胞的比例，或相对于对照归一化的荧光强度。因此，表3在可能的情况下包含了经核实的特定研究数值观察结果，但未使用人为的共同效率尺度对各制剂进行排序。亲脂性标签摄取仍受限于上述完整性和游离标签的限制。
3 植物源性囊泡制剂对肠道炎症及免疫微环境的调控
3.1 先天免疫调控
当前关于植物囊泡介导的肠道先天免疫调控研究主要集中在巨噬细胞、炎症小体和中性粒细胞相关性损伤。巨噬细胞是植物源性囊泡制剂研究最为深入的靶点之一。葡萄柚、枸杞、生姜、人参、姜黄、穿心莲、杨梅、木兰等来源的制剂均显示出对巨噬细胞活性的调节作用，包括诱导HO-1、调节细胞因子分泌、促进M2型极化等。炎症小体研究提供了日益特异的机制证据。鱼腥草、梅、槐米等来源的制剂通过干扰NEK7-NLRP3相互作用等方式抑制NLRP3炎症小体激活。异常的中性粒细胞激活和NET形成将免疫介导的损伤与上皮恢复联系起来。黄连ELNs通过递送miR-5106减少Slc39a2表达，恢复中性粒细胞锌稳态，减少NET形成和上皮焦亡，并增加IEC/ISC相关增殖。植物囊泡介导的先天免疫研究正从描述细胞因子变化转向将“特定免疫细胞-功能性货物-分子靶点-组织结局”联系起来的机制证据。尽管关于巨噬细胞极化、NLRP3炎症小体和NETs的证据丰富，但这些免疫途径各自对最终黏膜修复的相对贡献尚不明确。
3.2 黏膜与适应性免疫调控
相较于先天免疫，植物源性囊泡制剂调节经典适应性免疫细胞群体的证据相对有限。当前研究主要集中在树突状细胞、T细胞相关应答及AhR-IL-22等黏膜稳态通路。西兰花衍生纳米颗粒是树突状细胞靶向的基础性证明。马齿苋、桑树皮、槐米、刺槐花等来源的制剂也显示出对AhR信号通路、IL-22诱导及免疫-上皮通讯的调节作用。当前证据表明两种主要的植物囊泡介导的黏膜免疫调节模式：在免疫细胞（如DCs）中进行直接的细胞内信号传导，以及通过涉及AhR、IL-22和抗菌防御的黏膜稳态通路调节免疫-上皮串扰。然而，关于Treg、Th17、B细胞及其他适应性免疫亚群调控的直接证据仍然稀少。
3.3 将炎症控制与黏膜修复联系起来
炎症控制可减少上皮损伤并改善再生环境，但并不确立完全的黏膜修复。证据应区分疾病改善、炎症控制、结构修复、再生活性和功能恢复。细胞因子减少主要支持抗炎活性；紧密连接和黏液相关变化、ISC反应及通透性测量则涉及不同的修复结局。在同一模型中组合这些终点可以阐明免疫调节是否伴随着组织和屏障恢复。
4 肠道屏障修复与上皮再生的证据
4.1 上皮保护、增殖与干细胞驱动再生
上皮存活、增殖和干细胞相关应答代表了黏膜修复的不同贡献。生姜、西兰花芽等来源的制剂显示出促进上皮增殖、改善受损单层完整性的作用。关于植物囊泡介导的ISC调控的最直接证据来自葡萄衍生类外泌体纳米颗粒（GELNs）。它们与Lgr5+ ISCs相互作用并促进类器官形成；GELN衍生脂质有助于ISC靶向，而β-连环蛋白信号的抑制减弱了再生反应。总体而言，有部分证据表明植物源性囊泡制剂可直接促进上皮和ISC功能以辅助黏膜再生。然而，包含长期谱系追踪、ISC特异性功能操作和持续组织再生评估的研究仍然稀缺。
4.2 上皮连接与黏液屏障的重建
多种植物源性制剂改善了肠道黏膜屏障的结构读数。芦荟、黄精等来源的纳米囊泡与紧密连接和黏附连接蛋白的恢复相关。在高脂饮食加重结肠炎的模型中，柑橘衍生ELNs增加了occludin和ZO-1，并改善了氧化应激、微生物和代谢读数。
4.3 从结构修复到功能性屏障恢复
结构标志物的改善本身并不确保屏障功能恢复。跨上皮电阻（TEER）、FITC-葡聚糖通透性、细菌易位及其他跨屏障转运测量可更直接地提供功能性证据。部分研究直接评估了功能性屏障结局。西兰花芽衍生的BSDExo改善了受损Caco-2单层的TEER。刺槐花ELNs改善了紧密连接和杯状细胞读数，并降低了小鼠的FITC-葡聚糖通透性。芦荟衍生纳米囊泡也与急性实验性结肠炎中肠道通透性的改善相关。一个悬而未决的问题是，屏障改善是否能在停止治疗或二次损伤后持续存在，并伴随正常的上皮更新。
5 植物源性制剂、肠道微生物群与黏膜修复
5.1 肠道微生物作为植物源性制剂的直接靶点
选定的植物源性制剂可被肠道细菌摄取，并通过膜组分、RNAs或其他生物活性成分改变细菌生长、基因表达或应激适应。例如，大蒜衍生ELNs中的peu-MIR2916-p3促进多形拟杆菌的生长。柠檬衍生ELNs增强鼠李糖乳杆菌GG和嗜热链球菌的胆汁耐受性和肠道存活，并改变乳酸和吲哚代谢产物的产生。
5.2 功能性微生物群重塑与代谢中继
植物源性囊泡制剂诱导的生态效应不仅限于微生物组成的变化，还可改变微生物代谢功能。由此产生的微生物代谢产物可作为关键的“代谢中继”，将植物纳米囊泡暴露与宿主黏膜反应联系起来，当前证据主要集中在色氨酸衍生代谢物和短链脂肪酸上。色氨酸-吲哚代谢是植物源性囊泡制剂介导微生物群-宿主串扰的最具机制定义的途径之一。槐米、大蒜等来源的制剂通过调节微生物色氨酸代谢，将微生物功能变化转化为宿主黏膜反应。近期工作进一步表明，植物囊泡介导的代谢调节超越了色氨酸-吲哚轴。羊栖菜和马齿苋来源的ELNs可重塑肠道微生物群，促进短链脂肪酸产生，并改善肠道屏障功能和炎症状态。植物囊泡-微生物群研究应从描述性群落组成和代谢物谱变化向前推进，走向利用粪菌移植（FMT）、单菌定植、代谢物干预或宿主受体阻断进行因果验证。植物纳米囊泡的疗效也可能依赖于宿主的基线微生物生态系统。
6 植物源载体的工程化治疗应用与递送优化
天然植物源性囊泡制剂表现出不同程度的胃肠道稳定性、生物相容性和细胞摄取能力。药物装载和进一步的工程化改造可以在这些固有特性的基础上改善货物稳定性、局部暴露和功能性递送效率。植物囊泡工程正从单独利用天然生物活性，向药物装载、口服递送优化以及靶向和胞内递送增强的方向发展。
6.1 使用植物源载体的药物和核酸递送
植物源性囊泡制剂和重构型脂质载体可容纳疏水性小分子和核酸用于局部肠道递送。鸡矢藤衍生ELNs装载穿心莲内酯改善了药物的分散性、稳定性、摄取和实验性抗...
