高危型HPV感染期间宫颈阴道脂质介质谱与后续病毒清除或持续感染的关联：一项探索性初步研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Cervicovaginal lipid mediator profiles during high-risk HPV infection associated with subsequent viral clearance or persistence: an exploratory pilot study

　　

背景：高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌的主要病因，而大多数感染会被机体自发清除。尽管与HPV结局相关的局部免疫和微生物因素已有研究，但宫颈阴道微环境中脂质介质（lipid mediators）的贡献仍鲜有表征。 方法：研究人员对一项前瞻性纵向HPV队列中30名参与者的宫颈阴道冲洗液样本进行了靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。样本来自HPV阴性女性、采样访视时HPV阳性但后续访视时相应HPV型别转为阴性的女性（后续清除组），以及采样访视时HPV阳性且后续访视时同一HPV型别仍可检出的女性（后续持续感染组）。 结果：在宫颈阴道冲洗液样本中共检出6种脂质介质。在HPV感染期间，后续清除组女性的总12-羟基二十碳四烯酸（12-HETE）和总14-羟基二十二碳六烯酸（14-HDHA）实测浓度高于HPV阴性女性。在基于百分比的次要分析中，后续清除组中前列腺素E2（PGE2）的相对占比低于HPV阴性组和后续持续感染组，而后续持续感染组中总14-HDHA的相对占比高于HPV阴性女性。对相关系数的直接比较发现，血栓素B2（TxB2）与14-HDHA的关系在后续清除组和后续持续感染组中呈现相反方向。 结论：HPV感染期间宫颈阴道总12-HETE和总14-HDHA浓度升高与后续访视时相应HPV型别的清除相关。在后续清除与持续感染中观察到的TxB2与总14-HDHA相反的关联进一步提示脂质介质协调性存在结局相关差异。这些探索性发现将脂质介质确定为HPV结局的候选相关标志物。

脂质介质谱与高危型HPV感染结局：清除与持续感染中的差异信号

一、研究背景与研究目的

高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染是宫颈癌发生的必要原因，但绝大多数HPV感染会被宿主免疫系统自然清除。尽管病毒持续感染是宫颈癌变的关键决定因素，但促进病毒清除或持续感染的局部机制仍未完全阐明。既往研究已证实，HPV清除与细胞介导免疫及宫颈微环境的变化相关，包括细胞因子产生改变和宫颈阴道微生物群落变化，提示局部黏膜免疫在决定感染结局中发挥核心作用。近年来宫颈阴道代谢谱研究进一步支持微生物组成、局部炎症、代谢物谱、HPV感染与宫颈疾病风险之间存在相互作用。然而，脂质介质对HPV持续感染与清除的贡献目前知之甚少。

女性下生殖道是一个复杂的黏膜生态系统，上皮细胞、常驻免疫细胞、微生物群落和可溶性介质相互作用以维持组织稳态并启动抗病毒应答。来源于花生四烯酸和ω-3多不饱和脂肪酸的脂质介质是炎症、宿主防御和组织修复的强效调节因子，能够影响白细胞募集和细胞因子产生。此外，来源于ω-3脂肪酸的脂质介质通过特异性促消退通路积极促进炎症消退，在恢复组织稳态的同时保留宿主防御机制，而促消退应答缺陷已被认为与慢性炎症和感染性疾病相关。脂质还可在全身和局部水平调节免疫细胞的活化、分化、代谢、膜信号转导和抗原呈递，从而将脂质产生与健康和疾病中的免疫应答调控联系起来。

在这些生物活性分子中，环氧化酶（COX）来源的前列腺素类和白三烯以及脂氧合酶（LOX）来源的代谢产物是主要的脂质介质家族，在黏膜免疫和组织稳态调控中发挥互补甚至相反的功能。前列腺素E₂（PGE₂）和血栓素B₂（TxB₂）通过环氧化酶依赖途径产生，而白三烯B₄（LTB₄）、12-羟基二十碳四烯酸（12-HETE）和15-羟基二十碳四烯酸（15-HETE）通过脂氧合酶介导的花生四烯酸代谢生成。此外，二十二碳六烯酸（DHA）来源的代谢产物如14-羟基二十二碳六烯酸（14-HDHA）日益被认为是与炎症调控和消退通路相关的DHA代谢产物。这些脂质介质共同构成相互连接的代谢回路，协调免疫应答的启动、放大和终止。因此，脂质介质通路平衡的扰动可深刻影响局部免疫应答，并与病原体清除失败、慢性炎症和疾病进展相关。

然而，HPV感染期间测得的宫颈阴道脂质介质谱是否与后续感染进程相关仍基本未知。研究人员因此假设，不同的宫颈阴道脂质介质特征与后续HPV清除或持续感染相关，反映了局部炎症和促消退免疫应答的差异。为回答这一问题，研究人员对来自未检出HPV的女性以及根据后续访视时型别特异性HPV状态分类的HPV阳性女性的宫颈阴道冲洗液样本进行了靶向LC-MS/MS脂质介质谱分析。

二、研究设计与主要技术方法

本研究使用了来自一项前瞻性纵向HPV自然史研究的存档宫颈阴道冲洗液样本。该研究于1990年至2014年间纳入13-21岁细胞学正常的健康女性，每4至6个月进行一次随访，包括性行为访谈、生理盐水宫颈阴道灌洗、HPV检测、细胞学检查和阴道镜检查。本研究选取30名女性，分为三组：HPV阴性组（n=14，采样访视前后两年内均未检出HPV）、后续清除组（n=6，采样访视时HPV阳性且下一次访视时相应型别转为阴性）和后续持续感染组（n=10，采样访视时HPV阳性且下一次访视时同一型别仍为阳性）。两组结局组的标本均在HPV感染期间采集，先于后续结局的确立。HPV检测基于PCR扩增，采用Roche Linear Array和内部Luminex平台。宫颈阴道冲洗液经灌洗采集、离心去除细胞碎片、分装后于-80°C保存至脂质组学分析。

主要技术方法为靶向脂质介质代谢脂质组学分析：将1.0 mL宫颈阴道冲洗液加入氘标记内标后进行冰甲醇蛋白沉淀、C18固相萃取，采用Agilent 1290 Infinity II超高效液相色谱系统联用Agilent 6495D三重四极杆质谱仪，在负离子动态多反应监测模式下进行检测。脂质介质通过色谱保留时间和特征性MRM跃迁与真实标准品比对进行鉴定。最终TxB₂、PGE₂、LTB₄、总12-HETE、总15-HETE和总14-HDHA六种介质满足检测和定量标准并纳入下游分析。羟基化脂肪酸（12-HETE、15-HETE、14-HDHA）在定量时未进行立体化学区分，其浓度代表相应R和S立体异构体的合并丰度。统计分析采用Kruskal-Wallis检验及Dunn事后两两比较，相关性分析采用Spearman相关系数及标签置换检验。

三、研究结果

3.1 HPV感染期间测得的脂质介质浓度与后续结局相关

研究人员使用靶向LC-MS/MS平台对宫颈阴道冲洗液样本中的脂质介质进行定量，TxB₂、PGE₂、LTB₄、总12-HETE、总15-HETE和总14-HDHA均被检出并定量。在三组间比较实测浓度后发现，后续清除组女性的总12-HETE和总14-HDHA实测浓度显著高于HPV阴性女性。后续持续感染组的实测浓度与HPV阴性组大体重叠。由于清除组标本在HPV阳性访视期间采集，这些结果共同表明，在随后清除高危型HPV感染的女性中，总12-HETE和总14-HDHA存在选择性富集产生。

研究人员还评估了脂质介质谱与吸烟、激素类避孕药使用和HPV基因型的关联。吸烟信息来自25名参与者，激素类避孕药使用信息来自19名参与者。经FDR校正后，吸烟与任何脂质介质均无显著关联。激素类避孕药使用与较高的TxB₂浓度存在名义关联（中位数1225.4对464.9 pg/mL；置换p=0.0249），但经六种介质校正后不再显著（q=0.149）。基因型特异性分析受限于每种基因型携带者数量较少；在HPV-16/18与其他检出基因型的探索性比较中，经FDR校正后无脂质介质差异显著。

3.2 检出介质池内相对占比的次要探索性分析

为探索靶向检测介质间的平衡关系，研究人员将每种介质表示为同一标本中六种稳定检出介质总和的百分比。结果显示，后续清除组中PGE₂的相对占比低于HPV阴性组和后续持续感染组；而后续持续感染组中总14-HDHA的相对占比高于HPV阴性女性。TxB₂、LTB₄、总12-HETE和总15-HETE的百分比差异均不显著。值得注意的是，总12-HETE和总14-HDHA在绝对浓度分析中观察到的差异在归一化至总检出介质池后明显减弱。这提示PGE₂相对占比降低和总14-HDHA相对占比升高可能发生在HPV状态相关的脂质介质产生整体转变的背景下。总体而言，成功的HPV清除可能与黏膜水平增强的脂质介质生物合成相关，优先产生总12-HETE和总14-HDHA，并伴随脂质代谢通路的整体重组。

3.3 脂质介质关联因后续HPV结局而异

由于脂质介质通过相互连接的酶促通路产生且常以协调方式发挥作用，研究人员评估了各研究组内绝对脂质介质浓度间的两两关联。在HPV阴性女性中，LTB₄与总12-HETE呈正相关（ρ=0.893），总12-HETE与总14-HDHA呈正相关（ρ=0.744）。在后续清除组中，总12-HETE与总14-HDHA呈完全秩相关（ρ=1.000）。在后续持续感染组中，LTB₄与总12-HETE的正相关（ρ=0.891）具有统计学意义。其他名义组内关联经15对介质多重比较校正后均不显著。

通过置换检验对组间相关系数进行直接比较，发现一个显著的差异相关：TxB₂与总14-HDHA在后续清除组中呈正相关（ρ=0.829），而在后续持续感染组中呈负相关（ρ=-0.689），组间差异经精确双侧置换检验显著（Δρ=1.518，p=0.0011）。HPV阴性组与任一HPV阳性结局组之间无相关差异在FDR校正后保持显著。该分析支持TxB₂-总14-HDHA关系在后续清除与持续感染之间存在特异性差异。

四、讨论与结论

本初步研究在HPV阳性访视时测量宫颈阴道脂质介质，并将其与后续访视时的HPV状态相关联。主要发现是，随后清除相应HPV型别的女性，其总12-HETE和总14-HDHA实测浓度高于采样前后两年内未检出HPV的女性。12-HETE通过花生四烯酸代谢产生，与白细胞活化、细胞迁移和炎症调控相关；14-HDHA是DHA来源的通路标志物，与炎症调控和消退相关。这两种介质在随后清除HPV感染的女性中同时升高，可能反映了花生四烯酸来源的炎症通路和DHA来源的促消退通路的协调激活。这种模式与平衡的黏膜免疫应答一致，即具有足够的炎症激活以促进抗病毒防御，同时启动消退机制以防止慢性炎症的建立并有利于病毒清除。

相比之下，后续HPV持续感染的女性未表现出可比的浓度变化，提示感染期间局部脂质介质应答较不显著。次要百分比分析显示，后续持续感染中总14-HDHA相对占比高于HPV阴性女性，而PGE₂在后续清除组中占检出介质池的比例低于两个比较组。相关矩阵还发现TxB₂-总14-HDHA关系在后续清除与持续感染之间呈显著分离，即清除组为正相关而持续感染组为负相关。这些发现共同确定了与HPV感染结局相关的候选脂质介质特征。

该观察可能在宫颈阴道环境中具有相关性，该处的免疫应答由上皮细胞、免疫细胞、可溶性介质和常驻微生物群之间的相互作用塑造。脂质介质可调节炎症和免疫应答，而微生物群组成与不同的细胞因子谱及不同的HPV清除或持续感染率相关。这些双向相互作用可能共同促成有利于病毒清除或持续感染的局部微环境。

研究局限性包括样本量较小（尤其后续清除组）、每位参与者仅单次采样、检出介质面板有限、羟基化脂肪酸定量未进行立体化学区分，以及缺乏配对样本和病毒学、免疫学、微生物学及临床协变量，这些限制妨碍了机制性解释。

结论：HPV感染期间宫颈阴道总12-HETE和总14-HDHA浓度升高与后续访视时相应HPV型别的清除相关，而后续持续感染未伴随可比的浓度变化。因此，成功的HPV清除可能与炎症相关和促消退脂质通路的协调激活相关，而持续感染可能反映了局部脂质介质应答不足或失调。从转化角度而言，本研究结果确定了供未来验证的候选脂质介质特征：感染期间较高的总12-HETE和总14-HDHA与后续清除相关，而PGE₂和总12-HETE的相对占比以及改变的介质相关性可能识别与后续HPV结局相关的特征。这些发现应在更大规模的纵向研究中通过配对采样和病毒载量、黏膜免疫及微生物群组成的整合测量加以验证。