基于酸性低共熔溶剂与超声辅助技术选择性提取大麦废弃物中酚类化合物的研究

《Frontiers in Analytical Science》：Selective extraction of phenolic compounds from barley waste using deep eutectic solvents

　　

本研究探讨了利用酸性低共熔溶剂（deep eutectic solvents, DES）结合超声辅助提取（ultrasound-assisted extraction, UAE）技术从大麦废弃物中提取酚类化合物的方法开发。研究人员采用单因素实验设计（One-Factor-at-a-Time, OFAT）对提取时间、温度及超声功率（ultrasound power, UP）等参数进行优化，并通过高效液相色谱-光电二极管阵列检测器（HPLC-PDA）测定总可定量酚类含量（total quantified phenolic content, TQPC）。此外，研究人员还评估了水分添加量对TQPC的影响。结果表明，使用氯化胆碱：甲酸（ChCl: formic acid）以1:2摩尔比配制，在70 °C、30 min、80% UP及10%水分的优化条件下，获得最高TQPC为5.78 mg/g；而使用氯化胆碱：酒石酸（ChCl: tartaric acid）以1:2摩尔比配制，在70 °C、25 min、100% UP及20%水分的条件下，TQPC为4.67 mg/g。所得TQPC分别比70%甲醇和70%乙醇提取高出5倍和4倍。液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC–MS-qTOF）分析显示DES提取物中含有多种酚类化合物，各化合物浓度范围如下：阿魏酸（ferulic acid）0.86–2.47 mg/g、儿茶素（catechin）0.12–2.16 mg/g、对香豆酸（p-coumaric acid）0.12–0.32 mg/g、柚皮素（naringenin）0.54–0.86 mg/g及芹菜素（apigenin）0.15–0.91 mg/g。扫描电子显微镜（SEM）分析证实DES处理后的样品中木质纤维素的可及性增强。研究人员采用AGREE、AGREEprep、CACI、BAGI及CaFRI绿色评估工具对UAE-DES提取的可持续性进行了评价，各工具评分分别为：AGREE 0.63、AGREEprep 0.57、CACI 65、BAGI 82.5及CaFRI 72，表明UAE-DES提取相较于70%甲醇和70%乙醇提取具有更优的绿色提取性能。

论文解读：基于酸性低共熔溶剂与超声辅助技术选择性提取大麦废弃物中酚类化合物的研究

一、研究背景与意义

啤酒工业每年产生大量废弃物，仅欧洲年积累量即达390–400万吨，其中啤酒糟（brewery spent grain, BSG）占副产物总量的85%，相当于初始麦芽重量的30%。BSG主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，可从中分离出酚类化合物，包括酚酸、黄酮类和花青素等。这些酚类化合物具有抗癌、抗炎和抗氧化特性，在制药、化妆品和食品工业中具有广阔应用前景。BSG中绝大部分酚酸以结合形式存在，含量约为3–5 mg/g（干重），主要为酯化于木质纤维素中的阿魏酸和对香豆酸，而游离酚酸含量不足0.5 mg/g（干重）。

传统上，大麦废弃物中酚类物质的提取多采用固液萃取（solid–liquid extraction, SLE），使用甲醇、乙醇或丙酮水溶液，但存在溶剂消耗量大、溶剂毒性高及需要额外纯化步骤等缺陷。酶解法虽为更绿色的方法，但存在提取时间长、酶对热和pH敏感以及成本限制等问题。因此，遵循绿色化学12原则，开发可持续、经济且无毒溶剂替代方案成为迫切需求。低共熔溶剂（deep eutectic solvents, DES）由氢键受体（hydrogen bond acceptor, HBA）和氢键供体（hydrogen bond donor, HBD）组成，其粘度和极性等理化性质被认为是酚类提取最重要的参数。水作为高极性溶剂可改善DES的理化性质及酚类化合物的传质效率。基于羧酸的DES已被报道为从木质纤维素废弃物中提取酚类化合物的高效溶剂，其HBD中的羟基（OH）基团可促进与纤维素和半纤维素基质内的分子间氢键作用，从而改善分析物的传质；同时，H?的质子活性可促进酚类化合物的溶解。

在此背景下，本研究旨在开发并优化一种超声辅助DES提取（UAE-DES）方法，以提高大麦废弃物中总可定量酚类含量（total quantified phenolic content, TQPC），并与传统70%甲醇和70%乙醇提取方法进行比较，同时采用多种绿色评估工具对方法的可持续性进行综合评价。

二、主要关键技术方法

研究人员采用以下关键技术手段开展研究：利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析DES形成过程中分子间相互作用的变化；采用单因素实验设计（OFAT）系统优化提取时间、温度、超声功率、溶剂与固相比例及水分添加量等参数；运用高效液相色谱-光电二极管阵列检测器（HPLC-PDA）对酚类化合物进行定量分析；采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC–MS-qTOF）进行酚类化合物的全面谱学鉴定；利用扫描电子显微镜（SEM）观察提取后残留物的形态结构变化；最后采用AGREE、AGREEprep、CACI、BAGI和CaFRI五种绿色评估工具对方法的可持续性进行综合评价。大麦废弃物样本采集自捷克生命科学大学（Czech University of Life Sciences, Prague）当地啤酒厂，经冷冻干燥和振荡研磨均质化后进行分析。

三、研究结果

3.1 FTIR分析

通过比较DES及其各起始组分的FTIR光谱，研究人员确认了广泛的氢键网络形成。氯化胆碱（ChCl）在3219 cm?1处对应羟基（–OH）伸缩振动，3026 cm?1和3005 cm?1对应N–H伸缩振动，1478 cm?1处为(CH?)?N?特征带。各羧酸在1580–1780 cm?1区域呈现典型羰基（C=O）伸缩振动带。在形成的DES溶剂中，各组分在3020 cm?1处的N–H和O–H尖锐峰转化为3100–3400 cm?1区域的宽吸收带，表明形成了广泛的氢键网络。其中ChCl:FA溶剂在2900 cm?1处出现新谱带，归因于氢键网络的形成和C–H伸缩振动。

3.2 ChCl:HBD摩尔比的影响

研究人员考察了1:1和1:2两种摩尔比，统计结果显示各摩尔比间无显著差异（F = 0.6620, p = 0.6662）。但ChCl:FA和ChCl:TA的TQPC随摩尔比增加而升高（分别从1.02升至4.93 mg/g干重和从0.52升至2.71 mg/g干重），而ChCl:AA和ChCl:CA仅轻微增加，ChCl:Mal和ChCl:MA则有所下降。因此，ChCl:MA和ChCl:Mal选用1:1摩尔比，ChCl:FA、ChCl:TA、ChCl:AA和ChCl:CA选用1:2摩尔比。粘度测定显示，ChCl:FA（1:2）和ChCl:MA（1:1）粘度最低（8.78–14.74 Pa·s），ChCl:CA（1:2）和ChCl:Mal（1:1）粘度最高（123.70–155.42 Pa·s）。

3.3 溶剂与固相比例的影响

在30–100 mg/mL范围内考察液固比对TQPC的影响。ChCl:AA、ChCl:Mal和ChCl:FA在各比例下TQPC相对稳定，而ChCl:CA、ChCl:TA和ChCl:MA随固相比例增加TQPC明显下降。1:50 mL/mg的溶剂与固相比例获得最高TQPC，被选为所有DES的最优比例。

3.4 超声时间的影响

在5–60 min范围内考察超声时间对TQPC的影响。随提取时间延长，TQPC显著升高（F = 3.35, p = 0.0138）。ChCl:FA、ChCl:AA、ChCl:MA和ChCl:TA的TQPC随提取时间增加而升高。最终确定各DES的最优超声时间：ChCl:FA为30 min，ChCl:AA、ChCl:MA和ChCl:TA为25 min，ChCl:Mal为20 min，ChCl:CA为15 min。

3.5 温度的影响

在24–80 °C范围内考察温度对TQPC的影响。温度从50 °C升至80 °C时TQPC显著增加（F = 5.038, p = 0.0027）。ChCl:FA的TQPC范围为1.96–4.93 mg/g干重，ChCl:TA为0.75–5.13 mg/g干重，ChCl:MA为0.52–1.45 mg/g干重。高温可降低溶剂粘度并促进酸的催化作用，从而改善木质素溶解。最终确定ChCl:MA和ChCl:AA的最优温度为80 °C，ChCl:FA和ChCl:TA为70 °C，ChCl:CA为60 °C，ChCl:Mal为50 °C。

3.6 超声功率的影响

在40%–100%范围内考察超声功率对TQPC的影响。提高超声功率显著增加了大多数DES的TQPC（F = 10.39, p = 0.0001），因为更高的超声功率增强了超声波的振幅和气泡内爆，促进木质纤维素的机械变化，从而改善酚类物质的溶解。最终确定ChCl:MA、ChCl:TA、ChCl:AA、ChCl:Mal和ChCl:CA的最优超声功率为100%，ChCl:FA为80%。

3.7 水分添加的影响

在10%–40%范围内考察水分添加量对TQPC的影响，统计上无显著效应（F = 1.3678, p = 0.2824）。ChCl:Mal在10%水分时TQPC为3.71 mg/g干重，ChCl:MA在20%水分时为3.12 mg/g干重，适量水分可降低粘度从而促进溶解。ChCl:AA和ChCl:CA在30%水分时效果最佳，ChCl:FA在10%水分时获得最高TQPC为5.78 mg/g干重，ChCl:TA在20%水分时为4.67 mg/g干重。最终确定各DES的最优提取条件为：ChCl:MA（80 °C、25 min、100% UP、20%水）；ChCl:AA（80 °C、25 min、100% UP、30%水）；ChCl:CA（60 °C、15 min、100% UP、30%水）；ChCl:FA（70 °C、30 min、80% UP、10%水）；ChCl:Mal（50 °C、20 min、100% UP、10%水）；ChCl:TA（70 °C、25 min、100% UP、20%水）。

3.8 LC–MS-qTOF酚类化合物鉴定

在最优条件下，LC–MS-qTOF筛查鉴定出多种酚类化合物，包括儿茶素（m/z 289.07）、表儿茶素（m/z 289.07）、阿魏酸（m/z 194.05）及其两种二聚体形式（m/z 385.09）、香豆酸的三种异构体形式（m/z 163.02）及香豆酸己糖苷（m/z 325.093）、咖啡酸（m/z 179.03）、香草酸（m/z 167.03）、白藜芦醇（m/z 227.07）、柚皮素（m/z 271.06）和芹菜素（m/z 269.04）。值得注意的是，芹菜素首次在大麦废弃物中被鉴定。相比之下，70%甲醇提取物中仅鉴定出儿茶素、香豆酸和柚皮素，70%乙醇提取物中鉴定出儿茶素、表儿茶素、两种咖啡酸异构体和柚皮素。

3.9 HPLC-PDA酚类化合物定量

ChCl:FA和ChCl:TA提取物中TQPC分别为5.78 mg/g干重和4.67 mg/g干重，比甲醇（1.16 mg/g干重）和乙醇（1.06 mg/g干重）提取高出约5倍和4倍。ChCl:Mal、ChCl:MA、ChCl:AA和ChCl:CA的TQPC分别为3.50、3.96、3.74和3.04 mg/g干重。ChCl:FA和ChCl:TA提取物中阿魏酸、儿茶素、白藜芦醇、柚皮素和芹菜素浓度最高，其中ChCl:FA中阿魏酸和儿茶素浓度高于ChCl:TA。与已有研究相比，本方法获得的TQPC显著高于水热DES提取（0.375 mg/g）和固液萃取（0.98 mg/g），与亚临界水水热提取（7.24–8.00 mg GAE/g）相当。

3.10 扫描电子显微镜（SEM）分析

SEM分析显示，未处理样品呈现低孔隙率的碎片化木质纤维素结构。70%甲醇和70%乙醇处理样品仅出现纤维网络的局部碎裂和裂纹原纤维，木质纤维素内无物理破裂。而DES处理样品中木质纤维素基质出现显著机械破坏，表面裂纹和孔隙形成增加，纤维束出现机械损伤和部分脱纤维化，表明结合态酚类化合物的可及性得到改善。

3.11 绿色评估

采用AGREE、AGREEprep、CACI、BAGI和CaFRI五种工具评估方法可持续性。DES提取的AGREE评分为0.63，高于70%甲醇（0.57）和70%乙醇（0.59）。AGREEprep评估中，含更浓缩酸（乙酸和甲酸）的DES评分为0.57，较温和酸（丙二酸、柠檬酸、苹果酸和酒石酸）的DES评分为0.69，高于70%甲醇（0.55）且与70%乙醇（0.67）相当。CACI评分为65，BAGI评分为82.5（高于传统溶剂的80），CaFRI评分为72。总体而言，DES方法在样品量小、溶剂用量低、废物产生少及DES可生物降解等方面具有优势，但半自动化、多步骤制备和较高能耗是需改进的方面。

四、结论

本研究开发了一种利用酸性低共熔溶剂结合超声辅助提取（UAE-DES）从大麦废弃物中提取酚类化合物的方法。TQPC随DES组成和提取参数的不同而变化。在最优条件下，ChCl:FA（摩尔比1:2）和ChCl:TA（摩尔比1:2）提取物获得最高TQPC，分别为5.78 mg/g干重和4.67 mg/g干重，比70%甲醇和70%乙醇提取高出5倍和4倍。LC–MS-qTOF分析揭示DES提取物中含有多种酚类化合物，包括阿魏酸、儿茶素、对香豆酸、柚皮素和芹菜素，其中芹菜素首次在大麦废弃物中被鉴定。通过5种绿色评估工具的评价表明，DES提取方法更符合绿色化学原则，获得了更高的可持续性评分。因此，本研究开发的DES方法可作为酚类化合物提取的高效替代方案，支持大麦废弃物的增值利用原则，助力循环经济和可持续环境目标的实现。