《Frontiers in Physiology》：Functional analyses of Apis cerana cerana DnaJC28: a new biomarker for environmental stress
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蜜蜂授粉对维持生态和农业系统的健康至关重要。然而，蜜蜂健康常受多种环境胁迫影响。因此，鉴定参与胁迫反应的关键基因并探究蜜蜂响应环境胁迫的分子机制至关重要。本研究报告中华蜜蜂（Apis cerana cerana）DnaJC28（AccDnaJC28）是一个典型
蜜蜂授粉对维持生态和农业系统的健康至关重要。然而，蜜蜂健康常受多种环境胁迫影响。因此，鉴定参与胁迫反应的关键基因并探究蜜蜂响应环境胁迫的分子机制至关重要。本研究报告中华蜜蜂（Apis cerana cerana）DnaJC28（AccDnaJC28）是一个典型的DnaJ蛋白，属于热激蛋白（heat shock protein，HSP）亚家族，含有J结构域，定位于细胞质。AccDnaJC28的mRNA水平在胸部高于其他组织，在1日龄工蜂中高于其他发育阶段的蜜蜂。多种环境胁迫因子可诱导AccDnaJC28的表达。功能分析表明，沉默AccDnaJC28降低了中华蜜蜂的耐热性，而其过表达则提高了果蝇（Drosophila）S2细胞在热胁迫下的存活率。这些结果表明AccDnaJC28在胁迫反应中发挥关键作用，并具有作为新型生物标志物的潜在适用性。机制分析进一步揭示，敲低AccDnaJC28降低了一些抗氧化酶的酶活性及相关抗氧化基因的表达水平。此外，某些抗氧化基因的上调表达可能部分补偿AccDnaJC28敲低引起的功能缺陷。综上所述，研究人员的发现表明AccDnaJC28对于中华蜜蜂响应环境胁迫至关重要，其通过抗氧化信号通路减轻氧化损伤。这些结果有助于理解蜜蜂应对环境胁迫时所启动的基础防御机制。
论文解读：中华蜜蜂DnaJC28作为环境胁迫新型生物标志物的功能解析
一、研究背景与科学问题
蜜蜂是众多农作物和野生植物的重要传粉者，对维持生态与农业系统的健康具有不可替代的作用。然而，近年来蜜蜂健康与蜂群 resilience 正受到多种环境胁迫因子的负面影响，包括低温、高温、紫外线（UV）辐射、除草剂百草枯、杀虫剂高效氯氰菊酯和阿维菌素等。这些胁迫因子不仅干扰蜜蜂的生长发育、降低其免疫能力和寿命，还可能导致蜂群崩溃。因此，解析蜜蜂抵抗环境胁迫的分子机制、鉴定能够提升蜂群抵抗力的关键基因或蛋白，已成为保护蜜蜂健康的重要科学议题。
热激蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一类能够折叠新生蛋白、修复变性蛋白并清除错误折叠蛋白的分子伴侣，同时在保护生物体抵御环境胁迫中发挥重要作用，被广泛视为胁迫反应的介导者和生物标志物。HSP40家族因含有J结构域而常被称为DnaJ蛋白，在多种物种中基因数量最多。DnaJ蛋白依据结构特征分为DnaJA、DnaJB和DnaJC三类。已有研究表明DnaJ蛋白在哺乳动物中功能多样，但DnaJC28在昆虫中的功能尚属空白。中华蜜蜂（Apis cerana cerana）是中国特有蜂种，对维持本土植物多样性至关重要。本研究旨在阐明AccDnaJC28的分子特征，并探究其是否介导中华蜜蜂抵御环境胁迫。
二、研究内容与总体结论
研究人员通过分子克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、表达谱分析、RNA干扰（RNAi）、异源过表达及抗氧化酶活性检测等一系列实验，系统解析了AccDnaJC28在中华蜜蜂环境胁迫响应中的功能。研究结论表明，AccDnaJC28是一个定位于细胞质的典型DnaJ蛋白，其表达受多种环境胁迫诱导；沉默AccDnaJC28降低中华蜜蜂的耐热性，而过表达则提高果蝇S2细胞的耐热性；机制上，AccDnaJC28通过调控抗氧化信号通路减轻氧化损伤，从而增强中华蜜蜂在胁迫条件下的存活能力，可作为环境胁迫的新型生物标志物。
三、主要关键技术方法
研究采用的主要技术方法包括：基于NCBI数据库和PCR扩增获得AccDnaJC28编码序列（coding sequence，CDS）；利用Pfam数据库、DNAMAN多序列比对、MEGA邻接法构建系统发育树及SWISS-MODEL三级结构预测进行生物信息学分析；以果蝇S2细胞为宿主，通过pUAST-6×Myc载体转染和免疫荧光染色确定AccDnaJC28的亚细胞定位；以曲阜师范大学饲养的中华蜜蜂蜂群（3个健康有王蜂群，各代表一个独立生物学重复）为材料，采用反转录定量PCR（RT–qPCR）检测不同组织、发育阶段及多种胁迫处理下的基因表达；通过饲喂dsRNA-DnaJC28进行RNAi基因沉默，并以dsRNA-GFP为对照；利用台盼蓝染色和血细胞计数器评估果蝇S2细胞在热胁迫下的存活率；使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性。
四、研究结果
（一）AccDnaJC28的序列分析与进化关系
AccDnaJC28的CDS长度为1125 bp，编码374个氨基酸。系统发育分析表明，AccDnaJC28与DnaJC亚家族关系更近，尤其与西方蜜蜂（Apis mellifera）DnaJC28（AmDnaJC28）同源性最高，多序列比对结果与进化树分析一致。
（二）AccDnaJC28具有典型的J结构域
Pfam数据库预测显示，AccDnaJC28的J结构域位于第41至125位氨基酸之间，由85个氨基酸组成。三级结构预测表明该J结构域由四个α-螺旋构成，特征性的组氨酸-脯氨酸-天冬氨酸（HPD）三肽位于螺旋II和III之间，符合典型DnaJ蛋白的结构特征。
（三）AccDnaJC28定位于细胞质
鉴于蜜蜂细胞难以培养，研究人员选用果蝇S2细胞进行亚细胞定位分析。将AccDnaJC28的CDS插入pUAST-6×Myc载体后转染S2细胞，经抗Myc抗体免疫染色和激光共聚焦显微镜观察，确认AccDnaJC28定位于细胞质。
（四）AccDnaJC28呈现时空特异性表达**
RT–qPCR结果显示，AccDnaJC28在中华蜜蜂头、腹、螫针、中肠、表皮、肌肉、触角、腿和直肠等多种组织中均有表达，其中胸部表达量最高。在发育阶段方面，AccDnaJC28在1日龄工蜂中表达量最高，在2日龄幼虫和白眼蛹中表达量也相对较高，提示其可能在中华蜜蜂生长发育中发挥重要作用。
（五）AccDnaJC28在不同程度热胁迫下发挥重要作用**
在33°C条件下，AccDnaJC28表达水平在5小时内无显著变化。当蜜蜂暴露于40°C、43°C和46°C时，AccDnaJC28表达量均升高，分别在处理2小时、5小时和4小时达到峰值。将处理时间延长至48小时后，40°C条件下AccDnaJC28从12小时至48小时均显著上调，表明热胁迫可诱导AccDnaJC28表达。
（六）其他胁迫因子诱导AccDnaJC28转录**
冷胁迫（4°C）下，AccDnaJC28在1小时时急剧升高，随后部分回落，4至5小时恢复至对照水平。H2O2和UV胁迫下，其表达量在处理3至5小时期间升高，分别在3小时和4小时达到峰值。百草枯、高效氯氰菊酯和阿维菌素处理也均能诱导AccDnaJC28表达上调，分别在处理2小时、1小时和2小时达到最大值。这些结果表明AccDnaJC28对不同环境胁迫均具有响应性。
（七）RNAi介导的AccDnaJC28敲低降低中华蜜蜂耐热性**
通过饲喂dsRNA-DnaJC28成功沉默AccDnaJC28，其中24小时时敲低效率最高，达86.95%。在43°C热胁迫条件下，AccDnaJC28敲低组蜜蜂的存活率显著低于dsRNA-GFP对照组，表明AccDnaJC28对中华蜜蜂耐热性至关重要。
（八）AccDnaJC28过表达提高果蝇S2细胞耐热性
由于蜜蜂难以进行转基因操作，研究人员利用果蝇S2细胞异源过表达AccDnaJC28。热胁迫处理后，过表达组细胞密度和活力显著高于对照组，48小时时尤为明显。台盼蓝染色结果显示，过表达组死细胞比例显著低于对照组，进一步证实AccDnaJC28过表达可增强细胞耐热性。
（九）AccDnaJC28敲低影响抗氧化相关酶及基因表达**
AccDnaJC28敲低后，CYP4G11、CDK5、CDK5r、Trx1、Trx2、Tpx4、Tpx5、Hsp22.6、MsrB、GSTO2、GSTS4、GSTD、GSTT1、SOD1和MKK4等15个抗氧化基因的表达水平显著上调；而CYP336A1、GSTZ1和TrxR1的表达水平显著下降；p38b和Tpx3的表达无显著变化。酶活性检测显示，AccDnaJC28敲低显著降低了POD和T-SOD的酶活性，而CAT活性无显著变化。这些结果表明AccDnaJC28敲低可能扰乱中华蜜蜂的抗氧化信号通路，而多个抗氧化基因的上调可能部分补偿其功能缺失。
五、讨论与结论
讨论部分指出，AccDnaJC28具有典型的DnaJ蛋白结构特征，是首个在动物中经实验确定亚细胞定位的DnaJC28蛋白，为其他物种中该蛋白的亚细胞定位研究提供了理论基础。AccDnaJC28在胸部的较高表达可能与其参与调节中华蜜蜂胸部温度、增强飞行能力和采集活动有关。AccDnaJC28受冷热胁迫诱导，且其沉默降低耐热性、过表达增强耐热性，表明该基因是中华蜜蜂温度调节的关键基因。UV胁迫和多种农药处理均能诱导AccDnaJC28表达，提示其参与UV响应性伴侣网络，并可能帮助蜜蜂抵御农药暴露。多种环境胁迫均可诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，而AccDnaJC28表达受H2O2诱导，表明其高表达是应对ROS升高的潜在保护策略。AccDnaJC28敲低降低了部分抗氧化酶活性和抗氧化基因表达，同时上调了其他抗氧化基因，提示AccDnaJC28通过激活抗氧化防御系统减轻氧化损伤。
研究结论部分可翻译为：综上所述，研究结果表明AccDnaJC28是一个定位于细胞质的典型DnaJ蛋白，可能作为环境胁迫的新型生物标志物发挥作用。AccDnaJC28可能通过激活抗氧化防御系统减轻氧化损伤，从而提高中华蜜蜂在胁迫条件下的存活率。这些发现有助于理解蜜蜂应对多种环境胁迫因子的防御机制，并为促进蜜蜂健康与福祉提供了理论基础。
