《Frontiers in Medicine》：Guizhi-Shaoyao-Zhimu decoction alleviates gastrointestinal acute graft-vs.-host disease and suppresses FGF2/PI3K/Akt signaling: insights from network pharmacology, WGCNA, molecular docking, and animal experiment
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目的： 评估桂枝芍药知母汤（GSZD）对胃肠道急性移植物抗宿主病（GI-aGVHD）的潜在预防作用，并探讨其潜在机制。
方法： 通过网络药理学鉴定GSZD的生物活性化合物和推定靶点。从公共数据库检索aGVHD相关基因，并通过整合两个公共转录组数据集的差异表达分
目的： 评估桂枝芍药知母汤（GSZD）对胃肠道急性移植物抗宿主病（GI-aGVHD）的潜在预防作用，并探讨其潜在机制。
方法： 通过网络药理学鉴定GSZD的生物活性化合物和推定靶点。从公共数据库检索aGVHD相关基因，并通过整合两个公共转录组数据集的差异表达分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定肠道损伤相关基因。进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建、富集分析和分子对接。在aGVHD小鼠模型中评估GSZD的作用及FGF2/PI3K/Akt信号通路的潜在参与。
结果： 共鉴定出183个候选化合物和705个GSZD靶点。数据库挖掘和转录组分析鉴定出816个aGVHD相关基因和161个肠道损伤相关基因。交集分析显示GSZD与aGVHD之间共享109个靶点，GSZD与aGVHD肠道损伤之间共享11个靶点。网络和富集分析突出了AKT1、FGF2和PI3K/Akt信号通路以供进一步评估。探索性分子对接为31个AKT1-化合物对和2个FGF2-化合物对提供了预测排名。在体内实验中，与未治疗的aGVHD小鼠相比，GSZD治疗的小鼠表现出生存期延长、体重减轻减少、临床表现和肠道病理损伤减轻、细胞因子功能障碍减弱、肠道屏障完整性指标改善、FGF2水平和PI3K/Akt磷酸化水平降低。单独补充外源性FGF2并未显著加重aGVHD，但部分逆转了GSZD治疗小鼠中GSZD的保护作用，并伴随PI3K/Akt信号的重新激活。
结论： GSZD在小鼠aGVHD模型中显示出对GI-aGVHD的预防作用。这些作用伴随炎症反应减弱和FGF2/PI3K/Akt信号降低，提示该轴可能有助于GSZD的保护作用。
一、研究背景与科学问题
异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是多种血液系统恶性肿瘤及非恶性血液疾病的重要治愈性治疗手段。随着G-CSF/ATG单倍型移植策略的进步，供者来源已不再是主要限制，而移植相关并发症的管理日益关键。急性移植物抗宿主病（aGVHD），尤其是胃肠道型（GI-aGVHD），仍是移植后非复发死亡（NRM）的首要原因。肠道屏障破坏促进细菌和脂多糖（LPS）易位，驱动脓毒症和失控的全身炎症；严重腹泻导致体液电解质失衡和蛋白丢失，造成不良临床结局和治疗不耐受。尽管已有钙调神经磷酸酶抑制剂（CNI）联合甲氨蝶呤、移植后环磷酰胺（PT-Cy）等预防方案，aGVHD发生率仍达40%–60%。一旦发生，治疗选择主要限于糖皮质激素，激素难治性患者预后普遍较差。因此，推进aGVHD预防和治疗策略的研究对于改善移植安全性和患者结局至关重要。
传统中药（TCM）具有丰富的理论和经验基础，已有多种中药复方或天然化合物被提出用于缓解aGVHD。桂枝芍药知母汤（GSZD）由桂枝、麻黄、附子、知母、白芍、白术、防风、生姜、甘草九味药材组成，既往研究显示其具有良好的抗炎和免疫调节作用，例如通过富集肠道Parabacteroides goldsteinii递送外膜囊泡激活Cav-1-Nrf2轴抑制中性粒细胞胞外陷阱形成以缓解类风湿关节炎，以及抑制NF-κB和NLRP3炎症小体激活减少IL-1β、IL-6和MCP-1产生以减轻尿酸钠晶体诱导的炎症。鉴于GI-aGVHD的发病机制涉及免疫应答失调、过度炎症级联和广泛细胞因子风暴，GSZD可能具有缓解GI-aGVHD的潜力，但该复方尚未在GI-aGVHD中报道。本研究基于网络药理学探索GSZD的生物活性成分和分子靶点，基于WGCNA和多数据库挖掘鉴定GI-aGVHD的关键靶点，并通过PPI网络分析、GO和KEGG富集分析及分子对接揭示GSZD可能通过抑制FGF2/PI3K/Akt信号通路缓解GI-aGVHD，最后利用GI优势型aGVHD小鼠模型验证其预防疗效和分子机制。
二、主要技术方法
研究人员首先从TCMSP数据库检索GSZD各药材化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18筛选候选化合物，并通过SwissTargetPrediction数据库预测靶点基因。aGVHD相关基因从GeneCards、OMIM、DrugBank、PharmGKB、SymMap、TTD和HERB七个公共数据库检索获得。肠道损伤相关基因通过对两个公共转录组数据集（GSE134662含53例样本、GSE168116含17例样本，均来自临床aGVHD患者肠道组织）进行批次效应校正、DESeq2差异表达分析和WGCNA共表达网络分析后取交集获得。随后构建PPI网络、进行GO和KEGG富集分析及AutoDock Vina分子对接。体内实验采用C57BL/6供体至BALB/c受体的完全MHC不相合aGVHD小鼠模型，GSZD以21.17 g/kg/天灌胃给药，FGF2以5.0 mg/kg/天直肠内给药，评估生存、体重、临床评分、组织病理、细胞因子、肠道屏障功能和信号通路蛋白表达。
三、研究结果
3.1 成分获取与靶点预测： 从TCMSP数据库获得1,221个天然化合物，经筛选保留183个候选分子，预测获得705个独特靶基因（Gene List A）。
3.2 aGVHD相关靶点获取： 通过7个数据库检索获得816个aGVHD相关基因（Gene List B）。
3.3 aGVHD肠道损伤相关靶点分析： 整合两个肠道转录组数据集共70例样本，校正批次效应后鉴定出2,378个差异表达基因（DEGs）。WGCNA在power=20下构建网络，经模块合并最终获得11个模块，其中4个模块与aGVHD显著相关（Darkgrey、Black、Darkgreen、Darkturquoise）。模块相关基因与DEGs取交集获得161个aGVHD肠道损伤相关基因（Gene List C）。
3.4 复方靶点与疾病基因网络分析： Gene List A与Gene List B共享109个基因，与Gene List C共享11个基因（FGF2、SNCA、TBXAS1、HSD11B1、PTAFR、PTGFR、GPBAR1、HRH2、C5AR1、CACNA2D1、PDE4B）。PPI网络分析显示度中心性最高的10个基因为IL6、TNF、IL1B、AKT1、STAT3、PIK3CD、MTOR、NFKB1、TLR4、BCL2，高置信度阈值下结果稳健（Spearman ρ=0.912）。
3.5 GO和KEGG分析： 共享基因主要富集于信号转导、炎症反应、免疫应答等生物学过程，KEGG分析显著富集于PI3K-Akt信号通路、NOD样受体信号通路、Th17细胞分化、趋化因子信号通路等。
3.6 分子对接结果： AKT1与31个化合物对接得分范围为?9.2至?6.2 kcal/mol，FGF2与Lactiflorin和Paeoniflorin对接得分分别为?6.8和?6.6 kcal/mol。
3.7 GSZD质量控制： 通过UPLC-MS/MS在MRM模式下成功检测9种标志化合物，其中知母皂苷BⅡ含量最高（4,522.62 μg/g），其次为反式肉桂酸（2,077.09 μg/g）、芍药苷（1,764.51 μg/g）等。
3.8 GSZD缓解小鼠aGVHD： 与aGVHD组相比，GSZD治疗显著延长生存期、减轻体重下降、降低临床评分。GSZD部分恢复失调的细胞因子水平（降低IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17A，升高IL-4），减轻小肠和结肠病理损伤，降低肠道通透性并恢复紧密连接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）表达。GSZD降低结肠组织FGF2水平及PI3K和Akt磷酸化。单独FGF2补充未显著加重aGVHD，但在GSZD治疗小鼠中部分逆转了GSZD的保护作用并伴随PI3K/Akt信号重新激活。
四、讨论与结论
讨论部分指出，GI-aGVHD是allo-HSCT后NRM的主要原因，涉及同种异体免疫激活、细胞因子风暴放大和肠道屏障破坏的综合效应。GSZD传统上用于治疗“痹证”，主要在类风湿关节炎等炎症性关节疾病中研究，但其抗炎和免疫调节作用与aGVHD的多个核心炎症过程存在生物学交汇点。单靶点干预可能不足以控制aGVHD的多阶段、高度互联的发病机制，而GSZD作为多成分、多靶点的中药复方可能提供更全面的疾病网络调控。数据库挖掘提供广泛的先验知识，转录组分析补充组织特异性证据，二者互补。动物实验采用经典B6-to-BALB/c完全MHC不相合模型，诱导强烈的供者T细胞同种异体反应、典型aGVHD表现和显著肠道损伤，GSZD在生存、体重、临床评分、组织病理和屏障功能方面的一致改善表明其降低了aGVHD总体严重程度。
研究结论为：GSZD在小鼠aGVHD模型中显示出对GI-aGVHD的预防作用，这些作用伴随炎症反应减弱和FGF2/PI3K/Akt信号降低，提示该信号轴可能有助于GSZD的保护作用。这是首次基于网络药理学研究策略探讨GSZD作为GI-aGVHD潜在干预手段的研究，为GSZD预防性用于GI-aGVHD提供了新的临床前证据。
