伊曲茶碱通过恢复抑制性神经传递与调控cAMP/PKA/CREB信号通路预防中枢神经系统氧中毒

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Istradefylline prevents central nervous system oxygen toxicity

　　

中枢神经系统氧中毒（CNS-OT）是由吸入过高氧分压气体所诱导的毒性反应，目前缺乏有效的主动预防和治疗措施。研究人员在既往研究提示腺苷A2A受体（A2AR）信号通路参与其中的基础上，考察了已获批的A2AR拮抗剂伊曲茶碱（KW-6002）在雄性小鼠中的预防效果。研究发现，小鼠经口预给药伊曲茶碱（0.5–20 mg/kg）可显著延长癫痫发作潜伏期，并在30 min的100%氧气、5个绝对大气压（ATA）暴露期间显著降低癫痫发作的强度与频率。皮层靶向代谢组学分析显示，高压氧（HBO）暴露降低γ-氨基丁酸（GABA）并升高谷氨酸（Glu）；伊曲茶碱升高皮层GABA含量，但未显著降低皮层Glu含量。独立的酶联免疫吸附测定（ELISA）结果显示，伊曲茶碱处理组小鼠的海马Glu含量低于HBO暴露的溶媒对照组，而其他检测脑区的降低未达统计学显著水平。在纹状体中，伊曲茶碱与较低的环磷酸腺苷（cAMP）、免疫反应性蛋白激酶A（PKA）蛋白浓度及磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（p-CREB）相关，同时伴随GluA1 Ser845磷酸化降低及GABAA受体β3亚基Ser408/409磷酸化升高。在皮层中，丙二醛（MDA）水平降低、过氧化氢酶（CAT）活性升高，而谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性进一步降低。纹状体白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA水平亦降低。上述发现支持伊曲茶碱对雄性小鼠HBO诱导癫痫发作具有预防效果，并确定了与之相关的神经递质水平、受体磷酸化、信号标志物、氧化应激指标及炎症基因表达的变化。这些结果为开发具有潜在临床应用价值的中枢神经系统氧中毒主动预防和治疗策略提供了理论基础。

一、研究背景与目的

中枢神经系统氧中毒（CNS-OT）是指机体吸入超过一定压力的氧气并持续较长时间后，中枢神经系统出现的一系列毒性反应，主要发生于军事及民用潜水、高压作业和高压氧治疗（HBOT）过程中。当吸入氧分压超过280 kPa（相当于水深18米）时，短时间内即可出现毒性反应，且压力越高，发作潜伏期越短。发作时最严重的表现是全身强直-阵挛性癫痫发作，即“氧惊厥”，严重威胁高压氧暴露人员的生命安全，也制约了潜水作业效率及高压氧治疗的临床应用。目前针对CNS-OT缺乏有效的主动预防措施，管理主要依赖限制氧暴露压力与时间等被动策略。因此，寻找能够主动预防氧惊厥的措施，对于在更高压力下安全使用氧气具有重要意义。

既往研究表明，高压氧暴露可通过抑制腺苷激酶（ADK）活性并增强5′-核苷酸酶活性而升高细胞外腺苷水平。腺苷主要通过G蛋白偶联受体（GPCR）家族中的A1、A2A、A2B和A3受体调节神经功能。生理条件下，腺苷主要结合高亲和力A1受体（A1R），抑制突触前电压门控钙通道、减少兴奋性递质谷氨酸（Glu）释放，发挥中枢抑制作用；而在病理条件下，星形胶质细胞和小胶质细胞中A2A受体（A2AR）表达显著上调，促进神经炎症反应并加剧神经退行性变和癫痫发作风险。研究人员既往研究发现，A2AR激动剂CGS21680即使在0.003–0.1 μg的超低剂量下也能显著缩短氧惊厥潜伏期，而A2AR拮抗剂SCH58261在1–30 μg剂量范围内可显著延长癫痫潜伏期，且多巴胺D2受体的激活或抑制均不影响上述效应。

基于A2AR在神经兴奋性传递、氧化应激和运动调控中的多重作用，研究人员提出A2AR可能是CNS-OT发病中的关键“分子开关”，其功能性拮抗剂具有开发为CNS-OT预防药物的潜力。伊曲茶碱（KW-6002）是由协和发酵麒麟株式会社开发的高效、高选择性A2AR拮抗剂，2013年3月获日本医药品医疗器械综合机构（PMDA）批准上市，2019年8月获美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为左旋多巴的添加治疗用于帕金森病“关期”患者。本研究旨在系统评估伊曲茶碱对高压氧（HBO）暴露小鼠的预防效果，并检测多个脑区中神经递质水平、cAMP/CREB相关信号标志物、氧化应激指标及促炎细胞因子mRNA表达的变化。

二、主要技术方法

研究采用雄性C57BL/6小鼠（体重22–26 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（上海）2022–0001），所有动物实验经海军军医大学实验动物护理和使用委员会（IACUC）批准（批准号IACUC-2023-045）。主要技术方法包括：采用小型动物高压氧舱（RDC150-300-6）建立CNS-OT模型，以100%氧气加压至5个绝对大气压（ATA）并持续暴露30 min，记录癫痫发作潜伏期、频率和严重程度；采用SCIEX QTRAP 5600+质谱仪进行皮层靶向代谢组学分析，绝对定量神经递质；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测皮层、海马和纹状体中γ-氨基丁酸（GABA）和Glu含量，以及纹状体中环磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）和磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（p-CREB）水平；采用Western blot检测纹状体中AMPA受体（AMPAR）GluA1亚基Ser845位点和GABA_A受体β3亚基Ser408/409位点的磷酸化水平；采用生化试剂盒检测皮层中丙二醛（MDA）含量、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性；采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测纹状体中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA表达水平。

三、主要研究结果

1. 1.
   KW-6002剂量依赖性地减轻氧惊厥

在0.5–20 mg/kg剂量范围内，KW-6002均能有效延迟氧惊厥发作、减少发作频率并降低发作严重程度。其中2.5和5 mg/kg剂量组中，无癫痫发作小鼠比例达6/7（85.7%）。基于疗效与潜在脱靶效应及系统毒性的平衡考虑，后续机制研究选择5 mg/kg作为最佳剂量。在该剂量下，KW-6002组仅1只小鼠在约26 min时出现一次2级癫痫发作，而对照组6只小鼠均在暴露前10 min内出现癫痫发作，且对照组小鼠的发作频率和严重程度评分均显著高于KW-6002组。

1. 2.
   KW-6002恢复大脑皮层GABA/Glu平衡

皮层靶向代谢组学分析显示，与正常组相比，对照组皮层GABA含量显著降低，而KW-6002处理可逆转这一降低；Glu水平在对照组和KW-6002组均较正常组显著升高，但两个HBO暴露组之间无显著差异。Glu/GABA比值作为兴奋性与抑制性神经传递失衡的关键指标，在对照组中较正常组显著升高，而KW-6002有效逆转了这一变化。ELISA结果进一步显示，5 mg/kg KW-6002有效逆转了皮层、海马和纹状体中GABA水平的下降，但仅在 hippocampus 中显著降低了Glu水平，皮层和纹状体中Glu水平无显著变化。

1. 3.
   KW-6002调节A2AR偶联的Gs蛋白信号通路

KW-6002处理显著减弱了HBO暴露诱导的纹状体cAMP、PKA和p-CREB水平升高。Western blot分析显示，HBO暴露本身未显著改变纹状体AMPAR磷酸化水平，而KW-6002给药显著降低了AMPAR的磷酸化状态；同时，KW-6002恢复了HBO暴露后降低的GABAR磷酸化水平。

1. 4.
   KW-6002减轻HBO诱导的皮层氧化应激

HBO暴露导致皮层MDA水平显著升高，KW-6002将其显著降低至与正常组相当的水平。KW-6002有效逆转了HBO暴露诱导的CAT活性下降。GPx活性在HBO暴露后降低，并在KW-6002给药后进一步受到抑制。

1. 5.
   KW-6002减轻小鼠纹状体神经炎症

RT-qPCR结果显示，对照组纹状体中IL-1β、IL-6和TNF-α三种促炎细胞因子的mRNA水平均显著升高，而5 mg/kg KW-6002有效逆转了这一趋势。

四、讨论与结论

CNS-OT的发病机制极为复杂，涉及HBO暴露期间过量活性氧（ROS）的毒性作用、兴奋性与抑制性神经递质失衡、压力诱导的细胞受体功能改变、酸中毒及脑血流变化等多方面因素。目前报道的CNS-OT候选药物主要包括抗氧化剂、吡哆醇和低剂量镇静剂/麻醉剂，但多数强效抗氧化剂的疗效尚无定论；而镇静催眠药、抗惊厥药和麻醉剂与高压氧联用会对呼吸和循环系统产生协同抑制作用，并可能掩盖癫痫发作的前驱预警症状，即使低剂量也会损害高级神经功能，在潜水作业中存在安全隐患。

本研究证实，HBO暴露降低脑内GABA水平，而KW-6002主要通过维持GABA含量在相对较高水平来对抗氧惊厥。在受体水平，HBO暴露显著降低GABAR磷酸化水平，AMPAR磷酸化虽无统计学差异但呈上升趋势；KW-6002显著降低AMPAR GluA1亚基Ser845位点磷酸化并升高GABA_A受体β3亚基Ser408/409位点磷酸化，提示有效调节受体活性是其拮抗氧惊厥的重要途径。在信号通路水平，HBO暴露显著上调cAMP、PKA和p-CREB表达，KW-6002有效抑制这一上调，通过双重调节机制——抑制AMPAR磷酸化降低突触兴奋性，同时促进GABA水平和GABA_A受体磷酸化增强中枢抑制——维持神经元相对稳定。在氧化应激方面，KW-6002降低MDA水平并部分恢复CAT活性，但进一步降低GPx活性，后者可能与A2AR通路对GPx1的正向调控有关。在神经炎症方面，KW-6002显著降低IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA水平，提示其保护作用与抗炎特性密切相关。

研究结论：本研究评估了伊曲茶碱在HBO暴露前1 h给药的预防干预效果，结果表明预处理可预防HBO诱导的CNS-OT癫痫发作。其潜在机制涉及多个靶点和信号通路，包括通过抑制cAMP/PKA/CREB通路的过度激活来调节神经递质水平及其受体活性，以及减轻氧化应激和抑制神经炎症。鉴于伊曲茶碱是已上市药物且具有确证的人体安全性，其在对抗人类CNS-OT方面具有显著的临床转化潜力。但需要指出的是，本研究结果支持A2AR相关信号通路在HBO诱导CNS-OT中的潜在作用，但并未证实伊曲茶碱的保护效应是特异性通过A2AR介导的，仍需遗传学和互补药理学研究来验证这一受体依赖性。