代谢组学解析与体外生物活性评价：叙利亚牛至内生真菌枝孢霉属AUMC 15471的研究

《Frontiers in Pharmacology》：Metabolite profiling and in vitro biological activities of an endophytic Cladosporium sp. AUMC 15471 isolated from Origanum syriacum L

　　

摘要翻译：

背景：与牛至植物（O. syriacum L.）相关的内生真菌尽管具有作为生物活性天然产物来源的潜力，但仍 largely 未被充分开发。

目的：本研究旨在鉴定从叙利亚牛至叶片中分离的内生真菌枝孢霉属（Cladosporium sp.）AUMC 15471，并研究其化学谱系和生物活性。

方法：通过形态学和分子方法对枝孢霉属（Cladosporium sp.）进行鉴定。采用互补的色谱和质谱技术，包括气相色谱-质谱联用（GC–MS）、高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS），对乙酸乙酯（EtOAc）粗提物进行全面代谢物谱分析。

结果：GC–MS分析基于质谱数据库匹配和保留指数比较，初步注释了32种挥发性和半挥发性化合物，主要为单萜、倍半萜和脂肪醇。靶向LC–MS/MS分析检测到11种代谢物，根据保留时间和质谱特征与真实参考标准品比对进行归属。其中若干代谢物此前未在源自O. syriacum的内生枝孢霉属菌株中报道。EtOAc粗提物在DPPH测定中表现出中等抗氧化活性（IC₅₀ = 230.21 ± 5.96 μg/mL）。该提取物对HepG2肝细胞癌细胞显示低细胞毒性活性（IC₅₀ = 93.43 μg/mL），细胞死亡涉及凋亡和坏死两种途径。此外，该提取物对六种细菌表现出抗菌活性，包括五种食源性病原菌和一种机会性马病原菌，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制率为67.37% ± 2.45%，对空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）的抑制率为59.39% ± 1.24%。

结论：综合这些发现表明，与O. syriacum相关的枝孢霉属菌株是具有潜在生物活性的化学多样性代谢物的有前景来源。

论文解读

一、研究背景与目的

内生真菌是一类生活在植物组织内部而不引起宿主病害的微生物，能够产生多种具有药理活性的次生代谢产物，被认为是新药发现的重要资源。叙利亚牛至（Origanum syriacum L.）是中东地区广泛使用的药用植物，含有酚类、类黄酮、百里香酚、香芹酚等多种生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌等功效。然而，关于该植物内生真菌多样性的研究十分有限。枝孢霉属（Cladosporium）真菌广泛分布于多种环境，已有报道显示其内生菌株可产生抗菌、抗氧化等活性代谢物。本研究旨在从叙利亚牛至叶片中分离内生枝孢霉属真菌，对其进行分类鉴定，并通过多种色谱质谱联用技术解析其代谢物谱，同时评估粗提物的抗氧化、抗菌和细胞毒性活性，以探索该菌株作为生物活性天然产物来源的潜力。

二、研究内容与主要结论

研究人员从叙利亚牛至健康叶片中分离得到一株内生真菌，经形态学和基于ITS序列的分子鉴定确认为枝孢霉属（Cladosporium sp.）AUMC 15471。通过大米固体发酵获得乙酸乙酯（EtOAc）粗提物，利用GC–MS、HPLC-DAD和LC–MS/MS对代谢物进行综合分析。GC–MS初步注释了32种挥发性成分，主要包括单萜、倍半萜和脂肪醇；TMS衍生化后进一步检测到14种脂肪酸、芳香酸和酚类。HPLC-DAD定量了7种酚酸，其中绿原酸含量最高（7276.29 μg/g），其次为咖啡酸（4829.88 μg/g）。靶向LC–MS/MS检测到11种酚类化合物，3,4-二羟基苯甲酸含量最高（3563 μg/g）。生物活性实验显示，粗提物总酚含量为34.09 mg GAE/g，DPPH和ABTS自由基清除IC₅₀分别为230.21和183.70 μg/mL，FRAP还原力为23.61 μg Trolox eq/mg。抗菌实验表明，在1.5 mg/mL浓度下，粗提物对金黄色葡萄球菌抑制率最高（67.37%），其次为空肠弯曲杆菌（59.39%）。细胞毒性实验显示，粗提物对HepG2细胞IC₅₀为93.43 μg/mL，对BNL正常小鼠肝细胞在100 μg/mL内未达IC₅₀；流式细胞术分析表明，处理后HepG2细胞晚期凋亡和坏死比例增加，且S期细胞比例升高，提示DNA合成受损。

三、关键技术方法

研究使用了以下主要技术方法：（1）形态学与分子鉴定：基于ITS rDNA序列的BLAST比对和系统发育分析；（2）代谢物谱分析：GC–MS（结合保留指数和NIST库匹配）、HPLC-DAD（针对18种酚类标准品）和靶向LC-ESI-MS/MS（MRM模式，针对21种标准品）；（3）总酚含量测定：Folin–Ciocalteu比色法；（4）抗氧化活性：DPPH、ABTS自由基清除实验和FRAP铁还原实验；（5）抗菌活性：微量肉汤稀释法测定生长抑制率，测试6种细菌（包括大肠杆菌O157、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和红球菌属R. equi）；（6）细胞毒性：磺酰罗丹明B（SRB）法；流式细胞术分析细胞周期（PI染色）和凋亡/坏死（Annexin V-FITC/PI双染）。样本来源：植物材料采集自埃及Assiut商业苗圃，菌株保藏于Assiut大学真菌中心（AUMC 15471）。

四、主要研究结果

1. 真菌分离与鉴定：从15片叶片中分离出15株真菌，其中4株为枝孢霉属（分离频率26.7%）。选定一株进行深入研究，其ITS序列（533 bp）与Cladosporium sp.多个菌株具有99.44%–100%同源性，保守鉴定为Cladosporium sp. AUMC 15471（GenBank登录号OM854799）。

2. 抗菌活性：在单一浓度（1.5 mg/mL）下，粗提物对所有6种测试菌株均表现出可测量的生长抑制，其中对金黄色葡萄球菌抑制率最高（67.37% ± 2.45%），空肠弯曲杆菌次之（59.39% ± 1.24%），而单核细胞增生李斯特菌抑制率最低（12.65%）。由于仅测试了一个浓度，无法确定MIC/MBC，活性强度属于中等。

3. 细胞毒性：初步筛选显示提取物对HepG2细胞毒性最强，100 μg/mL时活力降至45.81%。剂量-反应实验确定HepG2 IC₅₀为93.43 μg/mL，而BNL细胞在最高浓度100 μg/mL下活力仍为89.42%，故IC₅₀ > 100 μg/mL。选择性指数（SI）约为1.07，不满足中等选择性（SI>3）标准。

4. 凋亡与坏死分析：Annexin V-FITC/PI双染流式结果表明，经IC₅₀浓度（93.43 μg/mL）处理48 h后，活细胞比例从95.82%降至84.40%，晚期凋亡细胞从0.36%增至5.98%，坏死细胞从2.20%增至8.91%，而早期凋亡细胞未增加。

5. 细胞周期影响：PI染色显示，处理后S期细胞比例从19.02%增至27.48%，G0/G1期从60.79%降至51.88%，G2/M期从20.29%降至15.44%，亚G1峰从2.65%增至6.71%，提示S期积累和DNA片段化。

6. 总酚含量与抗氧化：粗提物总酚含量为34.09 mg GAE/g。DPPH和ABTS IC₅₀分别为230.21和183.70 μg/mL（Trolox对照为6.50和4.69 μg/mL），FRAP为23.61 μg Trolox eq/mg。

7. 代谢物谱：GC–MS未衍生化样品中主要成分包括8-异丙基-1-甲基-3-亚甲基三环[4.4.0.0^2,7]癸烷（18.18%）、2-甲基-5-(1-甲基乙基)苯酚（14.95%）、萜品烯（10.75%）、杜松醇（8.86%）等。TMS衍生化后主要脂肪酸为油酸TMS衍生物（51.48%）、亚油酸TMS衍生物（37.06%）和棕榈酸TMS衍生物（9.55%）。HPLC-DAD和LC–MS/MS共确认了11种酚类化合物，其中绿原酸、咖啡酸、没食子酸、阿魏酸、对香豆酸等在两种方法中均被检测到。

五、讨论与结论

讨论部分指出，这是首次报道枝孢霉属与叙利亚牛至的内生关联。ITS序列鉴定存在局限性，该菌株被保守地鉴定为Cladosporium sp.，需要多基因座系统发育分析进一步确认物种。代谢物谱表明该菌株具有广泛的代谢能力，但部分酚类化合物（如没食子酸、绿原酸、咖啡酸等）既可能在植物宿主中存在，也可能由真菌产生，需要设置未接种培养基和宿主组织对照才能明确来源。抗菌和抗氧化活性为中等水平，属于粗提物复杂混合物的整体效应，不能归因于单一化合物。细胞毒性方面，HepG2 IC₅₀接近测试浓度上限，且与BNL细胞存在物种差异，需使用人源正常肝细胞进一步验证选择性。结论认为，该内生菌株具有化学多样性的代谢物谱，初步体外实验证明其粗提物具有抗氧化、抗菌和细胞毒性活性，但属于探索性发现，仍需通过活性指导分离、结构鉴定和体内研究来确定有效成分及其机制。