天然菌丝取向赋予杏鲍菇来源膜空间各向异性功能以引导骨再生

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Native hyphal alignment enables spatially anisotropic functions in Pleurotus eryngii-derived membranes for guided bone regeneration

　　

引导骨再生（Guided Bone Regeneration, GBR）膜需要在不同空间方向上协调力学支撑、成骨细胞调控和软组织排除等功能。具有空间异质性和各向异性的层级结构可能更好地满足这些方向依赖性功能需求。然而，自下而上构建此类结构通常依赖专用设备和复杂的多步骤制备工艺。相比之下，生物组织在生长过程中自发形成复杂异质且层级化的结构，为自上而下构建结构驱动型生物材料提供了独特价值。广泛栽培的杏鲍菇（Pleurotus eryngii）菌丝细胞壁主要由几丁质和β-葡聚糖构成，其子实体菌柄具有显著的纵向组织和适合切片的强健形态，因此仅通过改变切割方向即可产生不同的结构呈现。本研究采用相同的化学-酶联合处理，从杏鲍菇菌柄制备横切（Tr-C）和纵切（Tr-L）膜，该处理显著减少了细胞相关残留，同时保留了可辨识的管状菌丝结构。Tr-C和Tr-L表现出相似的整体化学特征，但切割方向引入的结构差异导致截然不同的功能状态。Tr-L在湿态力学行为上表现出更显著的方向性，对MC3T3-E1细胞具有更强的接触引导作用，增强成骨相关表型，并在膜厚度方向表现出更强的成纤维细胞排除能力。相比之下，Tr-C表现出更快的液体渗透和更大的水合能力。两种膜结构在炎症刺激下还诱导了不同的巨噬细胞响应模式。在大鼠颅骨缺损模型中，Tr-L促进了更显著的向心性新骨形成。这些发现表明，同一天然菌丝网络的不同结构呈现能够产生膜尺度的功能各向异性，凸显了天然菌丝组织在构建具有空间分化功能的GBR膜方面的价值。

论文解读：天然菌丝取向赋予杏鲍菇来源膜空间各向异性功能以引导骨再生

一、研究背景与问题

引导骨再生（Guided Bone Regeneration, GBR）是口腔种植和颌面骨缺损修复中广泛应用的骨增量技术，其核心原理是在骨缺损与快速增殖的软组织之间植入屏障膜，以维持稳定的再生空间和血凝块，为成骨细胞迁移和新骨形成创造有利环境。理想的GBR膜不仅需要良好的生物相容性和有效的软组织排除能力，还应具备足够的湿态力学稳定性、适当的液体和营养传输能力，以及与组织修复过程相匹配的降解特性。重要的是，这些功能需求在空间上并不均匀：面向骨面的一侧和膜内平面结构应支持成骨细胞的黏附、迁移和排列，而厚度方向则应有效限制成纤维细胞等软组织细胞向缺损内浸润。近年来具有分层、不对称或定向多孔结构的GBR材料试图在空间上协调细胞进入与软组织排除，进一步凸显了空间组织结构-功能关系在GBR膜设计中的重要性。

除材料组成带来的生化信号外，生物材料的力学性能、表面形貌和三维几何结构本身可作为持久的生物物理线索，调节细胞的黏附、铺展、迁移、取向和分化。与可扩散的生化因子不同，许多结构来源的生物物理线索在空间上局限于细胞-材料界面，主要依赖接触作用。特别是由排列纤维、微沟槽和有序多孔结构提供的接触引导可以重组细胞骨架并改变细胞形态和排列。然而，静电纺丝、微纳图案化、定向冷冻和三维打印等人工方法通常需要专用设备和多步骤制备工艺。相比之下，天然生物组织在生长过程中已具备复杂层级结构和内在方向性，保留并直接利用这些天然结构可能为构建结构驱动型生物材料提供更简便的途径。

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）菌柄具有显著的天然层级各向异性，其组织由相互连接的管状菌丝单元构成，细胞壁主要由几丁质和葡聚糖等结构多糖组成。近年来的结构分析表明，微米级菌丝优先沿纵轴排列，导致横切面和纵切面呈现明显不同的微观结构特征。然而，以往研究通常将蘑菇组织的内在方向性视为三维支架的预设属性加以保留和利用，不同切割平面对保存良好的管状菌丝网络在二维膜中的几何呈现有何影响，以及这种结构转译能否进一步产生膜尺度的不同功能，仍缺乏充分理解。

二、研究内容与结论

基于上述背景，研究人员以杏鲍菇菌柄为天然结构模板，分别沿横切和纵切方向切片获得不同结构呈现的膜样标本，并对两种标本施加相同的化学-酶联合处理，以显著减少残留DNA和蛋白质，同时尽可能保留可辨识的管状菌丝结构。研究人员假设定向切片能够通过改变同一天然三维菌丝网络在膜内的呈现方式，将其内在结构信息转译为膜尺度的功能各向异性。通过系统比较处理后的横切膜（Tr-C）和纵切膜（Tr-L）在微观结构、化学特征、湿态力学、液体渗透、水合能力、体外质量变化、巨噬细胞炎症反应、成骨细胞形态与取向、成骨相关表型、成纤维细胞跨膜迁移以及大鼠颅骨缺损模型中的体内骨再生效果，建立了连接天然菌丝结构、切割取向、功能各向异性、细胞行为与骨再生的构效关系。

研究结果表明，同一化学-酶处理显著降低了杏鲍菇组织中的残留DNA和蛋白质，同时基本保留了天然多孔管状菌丝结构和切割方向带来的结构差异。Tr-C和Tr-L具有相似的整体化学特征，但表现出明显的方向相关功能差异。Tr-L在沿菌丝主方向加载时表现出显著更高的湿态拉伸强度和弹性模量，而Tr-C表现出更快的液体渗透、更大的水合能力和更大的体外质量损失。在细胞层面，Tr-L对MC3T3-E1细胞表现出更强的接触引导作用，使细胞呈现更显著的伸长形态和高度一致的定向排列，并增强成骨相关表型；同时，Tr-L在膜厚度方向表现出更强的成纤维细胞排除能力。两种膜在脂多糖（LPS）刺激下还诱导了不同的巨噬细胞炎症输出模式。在大鼠颅骨缺损模型中，Tr-L促进了更显著的向心性新骨形成。

三、主要技术方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：杏鲍菇菌柄的横切与纵切定向切片制备膜样标本；Na?CO?/SDS化学处理结合β-葡聚糖酶酶解处理的化学-酶联合脱细胞方案；扫描电子显微镜（SEM）和H&E组织学染色用于结构表征；DNA和蛋白质残留定量分析；衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）用于化学特征分析；湿态单轴拉伸试验评估力学性能；动态液体渗透和水合质量比测定评估传输性能；RAW264.7巨噬细胞炎症响应评估（包括iNOS免疫荧光、CCK-8、TNF-α ELISA和Griess法）；MC3T3-E1细胞形态与取向分析（F-actin染色、方向性序参数计算）；成骨诱导后的碱性磷酸酶（ALP）活性和茜素红S（ARS）染色定量；Transwell体系评估成纤维细胞跨膜迁移；大鼠颅骨缺损模型结合显微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学评估体内骨再生效果。

四、研究结果

4.1 杏鲍菇来源膜的制备与结构表征

扫描电镜观察显示，未处理标本中横切面呈现大量横向和斜向菌丝截面，形态相对无序；纵切面管状菌丝结构主要沿共同方向排列，呈现清晰各向异性组织。处理后，两种切割方向的原始管状结构均保持可辨识，无整体塌陷或大规模结构破坏，与切割方向相关的取向特征基本保留。H&E染色显示处理后染色显著减弱，仅留下菌丝壁和周围基质的淡轮廓。DNA含量从约170–220 ng/mg降至30 ng/mg以下，减少约82%–86%；蛋白质含量从约10 μg/mg降至2.5 μg/mg以下，去除效率超过75%。Tr-C主要呈现横向和斜向菌丝截面，而Tr-L以沿膜平面排列的管状菌丝壁单元为特征。

4.2 不同切割取向杏鲍菇来源膜的化学特征、湿态力学与液体传输

ATR-FTIR分析显示不同切割取向标本在相同处理条件下呈现总体相似的谱图特征。处理后酰胺I带附近吸收减弱，1500–1200 cm?1区域谱图向几丁质参比方向偏移，β-葡聚糖特征吸收减弱，表明处理后几丁质相对贡献增加。湿态拉伸试验中，Tr-L（Ⅱ）的拉伸强度约1.48 MPa，显著高于Tr-L（⊥）的约0.19 MPa和Tr-C的约0.15 MPa；弹性模量约3.0 MPa，相比之下Tr-L（⊥）约0.54 MPa、Tr-C约0.33 MPa。液体渗透试验显示Tr-L沿菌丝主方向的液体迁移快于垂直方向，而Tr-C的渗透比Tr-L（Ⅱ）更快。水合质量比约34 g/g（Tr-C）和25 g/g（Tr-L）。4周体外质量变化中，Tr-C在三种介质中均表现出比Tr-L更低的剩余质量，H?O?条件下质量损失最大。

4.3 Tr-C和Tr-L对RAW264.7巨噬细胞炎症反应的影响

在无LPS刺激条件下，三种底物上TNF-α水平均保持低水平且无显著差异。LPS刺激后，Tr-C组的TNF-α水平（约7.26 ng/mL）显著低于Control组（约10.10 ng/mL）和Tr-L组（约11.85 ng/mL）。72小时时，LPS刺激下Tr-L组的亚硝酸盐浓度（约17.0 μM）显著低于Control组（约39.5 μM）和Tr-C组（约31.0 μM）。两种膜均未在无LPS条件下诱导明显的TNF-α或亚硝酸盐升高，表明两者本身不引发明显的持续促炎反应，但在LPS刺激下表现出时间依赖性和标志物依赖性的炎症输出调节差异。

4.4 Tr-C和Tr-L表面结构对MC3T3-E1细胞形态和取向的影响

CCK-8结果显示三种底物上细胞代谢活性随时间递增且组间无显著差异。Tr-L组的细胞中位长宽比增至3以上，显著高于Control和Tr-C组（约2）。底物取向序参数在Control和Tr-C组约0.05，而Tr-L组显著增至0.30以上。细胞取向序参数在Control和Tr-C组低于0.2，而Tr-L组显著增至约0.8。单细胞分析显示Tr-L组所有独立样本均呈现细胞长宽比随与底物主取向偏差角增大而减小的趋势。

4.5 Tr-C和Tr-L对成骨相关表型和成纤维细胞跨膜迁移的影响

ALP染色和活性测定显示Tr-L组显著高于Control组，Tr-C组虽均值高于Control但未达统计显著。ARS染色定量显示Tr-L显著高于Tr-C和Control，Tr-C与Control差异未达显著。Transwell试验中，Control组下表面观察到大量迁移细胞，Tr-C组仅见散在细胞，Tr-L组未见迁移细胞。两种膜均显著减少成纤维细胞迁移，Tr-L进一步显著低于Tr-C。

4.6 Tr-C和Tr-L促进大鼠颅骨缺损向心性骨再生

在大鼠双侧5 mm颅骨缺损模型中，micro-CT定量分析显示Tr-L组在骨体积分数（BV/TV）、骨密度（BMD）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）方面均表现出优于Tr-C和Control的趋势。组织学染色显示Tr-L组在6周和12周时均呈现更显著的向心性新骨形成。

五、讨论与结论

研究讨论指出，Tr-C和Tr-L具有相似的整体化学特征，但切割方向引入的结构差异导致截然不同的功能状态。Tr-L中沿膜平面长距离排列的管状菌丝单元提供了更长更连续的载荷传递路径，同时作为稳定的接触引导线索，将天然结构的方向信息传递到细胞群体尺度。相比之下，Tr-C暴露更多横向和斜向菌丝截面及管腔开口，与其更快的液体渗透和较弱的细胞屏障性能一致。Tr-L的结构优势并非简单地来自"更致密"或"更少孔隙"，而是来自取向依赖的功能分工：在膜平面内提供细胞引导，同时在膜厚度方向形成软组织屏障。这种面内细胞引导与厚度方向成纤维细胞排除的组合，与GBR膜对细胞调控和空间隔离的双重需求高度契合。

研究结论表明，同一天然菌丝网络的不同结构呈现能够产生膜尺度的功能各向异性。通过简单改变切割方向即可重新诠释天然菌丝结构中已编码的结构信息，无需创建新的各向异性。这一策略利用天然层级结构同时提供面内细胞引导和厚度方向软组织排除，为GBR膜设计提供了一种基于天然菌丝组织的简单途径，凸显了天然菌丝组织在构建具有空间分化功能的生物材料方面的价值。