国际空间站细菌单胺氧化酶基因的时间富集及太空分离株Leifsonia virtsii多巴胺驱动铵对秀丽隐杆线虫神经调节的影响

《Frontiers in Microbiology》：Temporal enrichment of bacterial monoamine oxidase gene aboard the international space station and neuromodulator impacts of dopamine-driven ammonium formed by space isolate Leifsonia virtsii on Caenorhabditis elegans

　　

多巴胺（dopamine, DA）调节神经系统功能，而DA缺乏与认知障碍和神经退行性疾病相关。多巴胺降解微生物的时空分布及其分解代谢产物对真核生物的影响尚不清楚。本研究展示了从国际空间站（International Space Station, ISS）乘员区分离的放线菌Leifsonia virtsii F6_8S_P_1AT中的DA代谢，并揭示了DA分解代谢产物驱动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）认知和趋化性调控。L. virtsii与来自陆生和水生生境的Leifsonia物种的16S rRNA基因序列相似性（>97.9%）和OrthoANI值（79.44–84.96%）均较高。研究发现，61.5%的有效建立Leifsonia物种（包括L. virtsii，但不包括ISS共分离株L. williamsii F6_8S_P_1BT）中存在编码单胺氧化酶（monoamine oxidase, MAO）的关键基因。ISS宏基因组分析显示，在微生物追踪研究（Microbial Tracking studies, MT1至MT3，2015–2022年）中，MAO相关特征呈现时间富集趋势，主要由MT3中与放线菌门（Actinomycetota）相关的候选MAO同源物驱动，而强F6-8S-P-1A样MAO信号仅限于两个MT2文库。DA输入刺激了L. virtsii生长早期的MAO基因表达，并促进了细胞分裂、生物膜建立和胞外NH4+的形成。随着时间延长和NH4+浓度增加，MAO表达下降，而代表DNA合成与转录（gyrB）、翻译（tuf）和生物膜形成（cslA）的标志基因表达同步上调。DA驱动的NH4+形成进一步改变了C. elegans的认知和趋化行为。分析表明，在L. virtsii中检测到的DA代谢通路并非ISS特异性特征，而是代表了一种从地球获得的表型。本研究提供了放线菌时空灵活性和异质性DA代谢能力的直接证据，同时证明DA分解代谢产物可调节真核模式生物的化学感应相互作用，并突显了MAO携带类群在ISS上的演替与持续存在。

一、研究背景、现存问题与研究意义

多巴胺（dopamine, DA）作为儿茶酚胺家族的重要神经递质，在调节认知功能（如决策、注意力、记忆、动机和奖赏）中发挥核心作用，其缺乏与抑郁症及神经退行性疾病密切相关。已有研究表明，肠道或临床微生物组可通过代谢左旋多巴（levodopa）或调节DA转运活性等方式与宿主DA通路发生互作，影响帕金森病治疗效果等。然而，关于DA降解微生物在人工封闭环境（如国际空间站，International Space Station, ISS）中的时空分布规律，以及DA分解代谢产物（特别是NH₄⁺）对真核生物行为的具体影响机制，尚缺乏系统性认识。此外，虽然ISS环境中已发现多种放线菌（Actinomycetota）物种，但其DA代谢潜能及其对宿主神经系统可能的调控作用仍属空白。因此，本研究旨在以ISS分离的新型放线菌Leifsonia virtsii为对象，结合计算机模拟、体外实验和体内模型，揭示其基于单胺氧化酶（monoamine oxidase, MAO）的DA代谢通路，评估该通路的时空分布特征，并探索DA分解代谢产物对模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）认知与趋化行为的调控效应，为理解微生物-宿主神经化学互作提供新框架。

二、研究概述与结论

研究人员通过全基因组及系统发育分析证实L. virtsii携带完整的DA降解基因簇（MAO、COMT、ALDH），而同一生态位共分离株L. williamsii则缺失MAO基因。ISS宏基因组时序分析（MT1–MT3，2015–2022）揭示MAO相关特征在ISS环境中呈现显著时间富集趋势，尤其在MT3阶段比例最高，且MAO信号主要归属于放线菌门相关类群，其中两个强阳性MT2文库与L. virtsii原始分离位点一致。体外实验表明，DA输入可促进L. virtsii的细胞分裂、活力和生物膜形成，并通过MAO催化产生胞外NH₄⁺导致培养基碱化。基因表达动力学显示，DA早期刺激MAO快速上调，但随着NH₄⁺积累和时间推移，MAO表达受抑，而DNA复制/转录（gyrB）、翻译（tuf）及生物膜形成（cslA）标志基因则同步上调。体内行为学实验利用C. elegans模型证实，DA分解代谢产物NH₄⁺在2.5–25 μM浓度范围内可诱导线虫正向趋化反应，且经L. virtsii分泌组预处理的线虫表现出对该分泌组的显著趋化偏好，提示可能涉及联想学习机制。该研究的重要意义在于首次提供了ISS微生物DA代谢的直接实验证据，揭示了放线菌中MAO的异质性分布及其时空灵活性，并证明DA分解代谢产物可调节真核模式生物的化学感应行为，为空间环境下微生物-宿主神经互作研究开辟了新方向。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：① 比较基因组学和系统发育分析：利用EzBiocloud进行16S rRNA基因相似性及OrthoANI分析，通过RAST注释筛选MAO、ALDH、COMT同源物，采用Proksee进行环形基因组比较，并使用Clustal_X和MEGA5基于最大似然法构建MAO氨基酸序列系统发育树。② ISS宏基因组筛查：从NASA三次微生物追踪任务（MT1–MT3，2015–2022年，共355个宏基因组）获取数据，利用DIAMOND blastx以L. virtsii MAO蛋白为查询序列进行同源搜索，设定严格阈值（氨基酸一致性≥70%/90%，覆盖度≥25/30 aa，e值≤1×10^-5/1×10^-10）区分候选与强阳性信号，并通过Kraken2进行分类学归属及BWA比对验证。③ 体外生理生化分析：采用紫外-可见分光光度法监测DA降解，alamar blue和酚红指示剂分别评估细胞代谢活性和pH变化，Bradford法和水杨酸-次氯酸盐比色法测定胞外蛋白和NH₄⁺-N浓度，结晶紫染色定量生物膜形成。④ 基因表达分析：通过实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测MAO相对表达量（以16S rRNA为内参），并结合半定量RT-PCR及ImageJ光密度分析评估MAO、gyrB、tuf、cslA的表达动态（以rpoD为内参）。⑤ 体内行为学实验：以C. elegans为模型，设计饥饿后趋化、预处理后联想学习趋化及无预处理趋化三类实验，通过计算趋化指数评估不同处理组（柠檬酸缓冲液CB、含DA的CBD、L. virtsii分泌组SUP及梯度浓度NH₄⁺）对线虫运动行为的影响。

四、研究结果

3.1 Leifsonia中潜在多巴胺分解代谢的异质性分布

通过文献调研重建了L. virtsii中DA降解为高香草酸（homovanillic acid, HVA）的可能酶促途径，发现其携带完整的MAO、COMT和ALDH编码基因。对13个有效建立的Leifsonia物种基因组筛查显示，MAO存在于61.5%（8/13）的物种中，而ALDH和COMT普遍存在；L. williamsii和L. xyli subsp. cynodontis缺失MAO。系统发育分析表明L. virtsii MAO与来自土壤、地衣等陆地生境的Leifsonia物种聚为一支，提示该表型非ISS特有。

3.2 ISS宏基因组中MAO特征的检测及时间富集证据

对355个ISS宏基因组的筛查发现，经过严格过滤后有85个宏基因组保留MAO同源证据，其中83个为候选阳性，2个为强阳性。MAO阳性频率在MT1为4.8%，MT2为12.5%，MT3升至30.1%，MT3显著高于MT1和MT2。两个强阳性文库均来自2018年2月6日采集的Node 2 Port乘员区样本，与L. virtsii原始分离位点一致，且读段以100%氨基酸一致性映射至L. virtsii MAO基因座。分类学分析表明候选MAO信号主要归属于放线菌门，尤其是Micrococcus和Leifsonia属。

3.3 DA刺激L. virtsii的细胞分裂、活力及生物膜形成

生长曲线和菌落计数显示，DA补充显著提高了L. virtsii在柠檬酸缓冲液（citrate buffer, CB）和胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth, TSB）中的生长速率和活菌数，而L. williamsii未表现类似响应。静态微孔板实验中，DA对L. virtsii浮游细胞影响不显著，但显著增强了其生物膜形成能力；L. williamsii本身生物膜形成能力强，但DA对其无促进作用。紫外-可见光谱分析证实L. virtsii对DA的降解作用，荧光和扫描电镜观察进一步验证了DA促进细胞增殖和生物膜形成。

3.4 DA代谢导致胞外NH₄⁺分泌及培养基碱化

L. virtsii在含DA的CB（CBD）中培养后，alamar blue还原率、培养基碱化程度、胞外蛋白和NH₄⁺-N浓度均显著高于不含DA的CB对照。L. williamsii虽也表现出碱化和NH₄⁺升高，但未见alamar blue还原增强，提示其可能通过替代途径产氨。

3.5 DA输入下参与DA分解代谢/NH₄⁺形成、DNA复制/转录、翻译及生物膜形成基因的差异调控

qRT-PCR显示，L. virtsii在DA存在下MAO相对表达量在4 h最高，随后随NH₄⁺积累和时间延长逐渐下降，至48 h完全抑制。RT-PCR和光密度分析表明，DA补充条件下，gyrB、tuf和cslA的表达在48 h显著上调，而CB对照组这些基因的表达水平较低。MAO在DA处理4 h即显著激活，而在CB中24 h才达峰值，提示DA特异性诱导和生长阶段依赖的转录调控共同参与。

3.6 NH₄⁺作为DA分解代谢产物调节C. elegans的认知和趋化行为

饥饿后的C. elegans对E. coli OP50表现出显著正趋化。预处理实验中，经E. coli、CB或CBD预处理的线虫对相应物质呈负趋化，而经L. virtsii分泌组（SUP）预处理的线虫对SUP呈显著正趋化，提示联想学习。无预处理条件下，线虫对SUP的正趋化显著强于CB。梯度浓度NH₄⁺（2.5–25 μM）与CB对比时诱导线虫正趋化，50 μM和0 μM效果减弱，表明存在感知阈值；当NH₄⁺与SUP对比时，趋化指数降低，可能由于SUP中其他趋化因子的干扰。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究的创新之处在于超越了传统ISS微生物定殖描述，提出了连接微生物神经递质代谢与真核宿主行为调控的新框架。比较基因组学和系统发育分析表明L. virtsii与多种陆生和水生Leifsonia物种遗传关系密切，且DA代谢能力在放线菌中呈异质性分布，非ISS特有。宏基因组数据显示MAO样同源物在ISS中广泛存在，但严格的L. virtsii样MAO信号罕见，两个强阳性MT2文库的匹配验证了该菌株的ISS起源。MAO携带类群（尤其Microbacterium属）在ISS中的演替和持续存在值得关注。研究人员也讨论了渗透压对趋化实验的可能混淆效应，并指出MAO对其他生物胺（如酪胺、色胺）的底物特异性有待进一步探究。

结论部分翻译如下：计算机模拟和体外实验数据支持L. virtsii中基于MAO的DA代谢，并确定了DA驱动的NH₄⁺形成对C. elegans体内行为的调节作用。然而，其他共存DA分解代谢产物对真核模型的潜在生理影响仍未解决。比较基因组学和MAO同源物的系统发育分析表明，在L. virtsii中检测到的DA降解并非ISS特异性特征，而是代表了在地球上广泛存在的祖先表型。MAO携带放线菌的时间富集反映了这些类群在ISS上的潜在演替和持续存在。进一步的基于重组MAO的测定、全基因组表达分析和/或敲除实验可能有助于阐明MAO和/或其他脱氨酶在DA降解及相关化学感应互作中的作用。