《Frontiers in Genetics》：Exploratory mRNA and microRNA profiling identifies transcriptomic alterations in the PIK3CA-related overgrowth spectrum
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背景： PIK3CA相关过度生长谱系（PIK3CA-related overgrowth spectrum，PROS）是一组由PIK3CA基因体细胞嵌合突变（somatic mosaic mutations）引起的疾病，其特征为累及多个器官（包括皮肤、脂肪组织
背景： PIK3CA相关过度生长谱系（PIK3CA-related overgrowth spectrum，PROS）是一组由PIK3CA基因体细胞嵌合突变（somatic mosaic mutations）引起的疾病，其特征为累及多个器官（包括皮肤、脂肪组织、血管、骨骼和神经系统）的组织过度生长。尽管PROS中PI3K-AKT-mTOR信号通路的组成性过度激活（constitutive hyperactivation）促进了异常组织发育、重塑和节段性过度生长，但其下游信号网络高度复杂，组织过度生长背后的精确分子机制仍未完全阐明。
方法： 在这项探索性研究中，研究人员通过对同一患者来源的病变皮肤成纤维细胞（pv-Fibro）和未受累皮肤成纤维细胞（non-pv-Fibro）进行mRNA和microRNA表达谱分析，研究了与PROS过度生长相关的分子改变。此外，来自三名健康个体的成纤维细胞被合并作为一个单一对照样本进行分析。
结果： 研究人员利用基于微阵列（microarray）的基因表达谱分析鉴定了24,034个人类mRNA。在pv-Fibro中筛选出10个候选病变相关上调基因（与nc-Fibro相比≥5倍，且non-pv-Fibro与nc-Fibro相比<2倍变化）；相比之下，在pv-Fibro中筛选出3个候选病变相关下调基因（与nc-Fibro相比≤0.2倍，且non-pv-Fibro与nc-Fibro相比>0.5倍）。在miRNA表达谱分析中，共检测了4,603个人类microRNA。hsa-miR-146a-5p在pv-Fibro中显著上调（与nc-Fibro相比≥5倍，且non-pv-Fibro与nc-Fibro相比<2倍变化），而hsa-miR-146b-5p显著下调（与nc-Fibro相比≤0.2倍，且non-pv-Fibro与nc-Fibro相比>0.5倍）。
讨论： 观察到的mRNA和miRNA表达变化代表了与PROS病理中炎症和组织重塑通路相关的候选分子改变。
论文解读
一、研究背景与科学问题
PIK3CA相关过度生长谱系（PIK3CA-related overgrowth spectrum，PROS）是一组由PIK3CA基因体细胞嵌合突变引起的疾病，该疾病概念于2013年前后提出，涵盖了一系列此前被视为独立实体的过度生长综合征，代表性病种包括巨脑-毛细血管畸形（MCAP）、先天性脂肪瘤过度生长、血管畸形、表皮痣和脊柱/骨骼异常（CLOVES）综合征等。这类疾病以累及皮肤、脂肪组织、血管、骨骼和神经系统的组织过度生长为特征。
PROS中已鉴定的复发性激活型PIK3CA错义变异包括螺旋结构域的E542K和E545K以及p110α催化亚基激酶结构域的H1047R。这些突变通过不同分子机制增强PI3Kα活性：螺旋结构域突变破坏p110α螺旋结构域与p85α调节亚基之间的抑制性相互作用，而激酶结构域突变H1047R则诱导构象变化，减少p85α介导的自抑制并增强膜相关激酶活性。这些突变增加了磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）的产生，进而激活下游AKT-mTOR信号通路。
尽管激活型PIK3CA突变是人类癌症中最常见的遗传改变之一，但PROS在本质上不同于肿瘤性疾病——PROS中的合子后体细胞嵌合突变主要促进组织过度生长、肥大和发育失调，而非恶性肿瘤特有的侵袭性生长和转移进展。然而，PROS的下游信号网络高度复杂，组织过度生长背后的精确分子机制仍不清楚。
历史上PROS的治疗主要为手术和激光治疗等对症干预。近年来，PI3K抑制剂（如alpelisib）已成为抑制组织过度生长的有前景的分子靶向疗法，但PI3Kα抑制对PROS神经系统表现（如神经发育迟缓、认知障碍和癫痫）的疗效仍未完全明确。
在此背景下，本研究旨在通过对患者来源的成纤维细胞进行mRNA和microRNA整合表达谱分析，探索PROS中与PIK3CA嵌合突变相关的分子改变。与跨个体比较容易受到性别、治疗史和个体间差异干扰不同，同一患者体内PIK3CA突变阳性和阴性皮肤样本的比较能够在相似的遗传和环境背景下实现个体内比较。
二、研究设计与主要技术方法
本研究采用以下关键技术方法：
样本来源： 研究对象为一名日本PROS患者，出生后第3天出现右侧躯体强直性癫痫发作，脑MRI显示左侧偏侧巨脑畸形，1岁7个月时因药物难治性癫痫接受大脑半球离断术。约12岁时出现左额部突出并逐渐进展，约20岁时左额部快速增大和面部过度生长导致左眼球受压，21岁时接受额骨和颧骨颅骨重建手术。病变组织病理学符合表皮痣特征。该患者携带仅在病变皮肤样本中检出的PIK3CA突变（NM_006218.3:c.3140A>G, p.(His1047Arg)），经全外显子测序（WES）和高分辨率熔解曲线（HRM）分析确诊为PROS。
成纤维细胞建立： 从该患者的正常皮肤和病变皮肤分别建立成纤维细胞系（non-pv-Fibro和pv-Fibro），PIK3CA嵌合突变仅在pv-Fibro中检出。正常对照成纤维细胞（nc-Fibro）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），来自三名健康个体并合并作为单一对照样本分析。
转录组分析： 采用Affymetrix GeneChip Human Gene 2.0 ST Array进行mRNA表达谱分析，采用GeneChip miRNA 4.0 Array进行microRNA表达谱分析。使用Affymetrix转录组分析控制台（TAC）软件以鲁棒多阵列平均（RMA）算法进行背景校正、归一化和探针汇总。差异表达通过倍数变化评估：pv-Fibro与nc-Fibro相比≥5倍或≤0.2倍分别定义为显著上调或下调；进一步以non-pv-Fibro与nc-Fibro比较进行病变相关筛选（上调候选者<2倍变化，下调候选者>0.5倍变化）。功能富集分析使用STRING数据库，富集显著性定义为p<0.05。
三、研究结果
3.1 mRNA和microRNA表达谱分析
在24,034个人类mRNA中，经xhyb过滤后17,599个进入进一步分析。pv-Fibro与nc-Fibro比较显示38个基因上调（≥5倍变化），36个基因下调（≤0.2倍变化）。上调基因富集分析显示细胞外基质组织、全身过程调节、细胞对生长因子刺激的响应调节、轴突导向、细胞-细胞黏附等生物学过程显著富集；STRING分析显示"含胶原细胞外基质"基因本体（GO）术语显著富集（p=0.0172）。下调基因富集分析涉及脂质稳态中ABC转运蛋白、血液循环调节、NABA ECM糖蛋白、细胞迁移负调控等通路；STRING分析支持ABC转运蛋白相关类别富集（p=0.0306）。
经病变相关过滤后，鉴定出10个病变相关上调mRNA：WFDC1、L1CAM、MX1、KCNMB1、OLFM2、MYH11、CORIN、DOK5、EPHA5和MT1F；以及3个病变相关下调mRNA：SFRP1、HOXB3和NRN1。
在4,603个人类miRNA中，pv-Fibro与nc-Fibro比较显示6个miRNA上调（≥5倍变化），4个miRNA下调（≤0.2倍变化）。经同样过滤标准后，鉴定出2个病变相关miRNA：hsa-miR-146a-5p（上调，6.0倍）和hsa-miR-146b-5p（下调，0.17倍）。
3.2 miR-146a-5p和miR-146b-5p的预测靶基因
使用miRDB数据库鉴定了30个hsa-miR-146a-5p预测靶基因（目标评分>90），其中WWC2、NUMB、CARD10和ZNF540在成纤维细胞组织中表达。但预测靶基因与本研究鉴定出的mRNA无重叠。DOK5被miRDB预测为hsa-miR-146b-5p靶基因（评分较低，52）。使用TargetScanHuman 8.0独立验证后，本研究鉴定出的10个上调或3个下调病变相关mRNA均未被预测为相应miRNA的靶基因，提示本数据集中未能建立病变相关mRNA与miR-146a/b计算预测靶基因之间的直接对应关系。
3.3 组织病理学发现与分子背景
pv-Fibro来源的病变组织病理学符合表皮痣特征。部分表皮痣源于PIK3CA基因体细胞嵌合突变，被认为是PROS临床谱系中的皮肤表现。
四、讨论与结论
讨论部分总结： 本研究通过同一PROS患者病变与未病变成纤维细胞的配对转录组分析，在最小化个体间变异的同时鉴定了病变相关转录改变，主要涉及细胞外基质组织、生长因子信号、细胞黏附、血管和平滑肌相关功能以及炎症反应通路。
上调mRNA可分为四个功能群：与组织结构和细胞间通讯相关的基因（WFDC1、L1CAM、EPHA5）；与发育和神经信号通路相关的基因（L1CAM、DOK5、EPHA5）；与炎症反应、应激适应和代谢稳态相关的基因（MX1、MT1F、WFDC1）；与代谢和稳态调节相关的基因（OLFM2、CORIN）；以及与血管和平滑肌功能相关的基因（KCNMB1、MYH11、CORIN）。下调基因中，SFRP1是Wnt信号通路抑制剂，其下调提示Wnt相关信号可能发生改变；HOXB3参与胚胎模式和神经嵴及中胚层来源组织的发育调控；NRN1主要涉及神经元发育和突触可塑性。
hsa-miR-146a-5p上调和hsa-miR-146b-5p下调提示PROS成纤维细胞中炎症信号可能发生改变。miR-146家族通过靶向TRAF6和IRAK1负调控NF-κB信号，作为先天免疫和炎症反应的反馈调节因子。但本研究未直接评估NF-κB活性，也未进行功能实验，因此不能建立因果关系。
研究局限性： 本研究仅包含单一患者样本，限制了结果的普适性；三名健康个体成纤维细胞合并作为单一对照，无法估计健康对照间的生物学变异，也无法进行常规统计比较；成纤维细胞无法完全再现PROS病变体内的细胞异质性、组织架构和细胞间相互作用；ABC转运蛋白富集的疾病特异性未确定；关键候选分子（WFDC1、SFRP1、hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-146b-5p）未通过RT-qPCR等实验独立验证，也未进行功能实验。因此，这些分子应被视为探索性候选分子而非已证实的分子标志物或治疗靶点。
研究结论： 本研究利用患者来源的成纤维细胞，在PIK3CA相关过度生长谱系（PROS）中鉴定了与疾病相关的mRNA和miRNA表达变化。这些结果提示炎症、组织重塑和发育信号通路的激活可能参与疾病病理过程。尽管受限于单一病例、基于成纤维细胞的分析以及缺乏功能验证，这些发现为PROS的分子景观提供了初步见解，可能有助于确定未来研究的方向。需要在更多PROS病例和实验模型系统中进一步研究以验证这些发现并阐明其对疾病发病机制的贡献。这些结果为未来研究PROS组织过度生长的分子机制奠定了基础。
