一种快速荧光重组酶辅助扩增法检测食源性肠球菌中多重耐药基因optrA的研究

《BMC Veterinary Research》：Real-time fluorescent recombinase-aided amplification for rapid detection of the multiple resistance gene optrA in Enterococcaceae pathogens

　　

摘要

背景

多重耐药基因optrA是使用噁唑烷酮类抗生素治疗携带该耐药基因细菌感染时治疗失败的主要原因之一。在全球范围内，多重耐药基因optrA在动物源性食品、人群以及整个食品链及其相关环境中的流行率日益升高。值得注意的是，肠球菌科病原体被认为是此类抗生素耐药基因（ARGs）最重要的储存库。因此，迫切需要一种快速、高效、准确的检测方法，以便同时筛查和监测肠球菌科病原体中的此类耐药基因。

方法

本研究建立了一种简便、快速、可视化的实时荧光重组酶辅助扩增（RT-RAA）检测方法，用于特异性检测肠球菌科病原体中的多重耐药基因optrA。基于optrA的保守区域设计了引物和探针，并开发了实时荧光重组酶辅助扩增（RT-RAA）检测方法。在优化反应条件后，利用重组质粒和细菌分离株对该方法的特异性、重复性和灵敏度进行了表征。对来自零售鸡肉的100株肠球菌科分离株进行了RT-RAA、常规PCR和qPCR的平行检测，以评估其实际性能。

结果

该方法可在37°C下于40分钟内完成包括粗提DNA提取、扩增和结果判读在内的整个工作流程。此外，优化后的荧光RAA检测方法可在体温下启动反应，无需精密仪器。方法学验证表明，荧光RAA检测系统具有高度特异性，与其他常见耐药基因携带菌株之间未观察到交叉反应。此外，该检测方法具有良好重复性和高灵敏度，最低检测限为2.22×101 copies/μL。为进一步评估其临床应用价值，采用三种检测方法——RAA、聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）——对100份临床鸡肉样本进行了平行检测。结果表明，RAA与PCR的检测一致率为98%，RAA与qPCR的检测一致率为99%。

结论

所建立的荧光RAA检测方法可有效检测食源性病原体中的多重耐药基因optrA，在临床和食品安全监测的现场检测应用中具有巨大潜力。