《Experimental Hematology & Oncology》：Innovations and emerging trends in adoptive cell therapies for solid tumors: engineering strategies and clinical translation
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中文翻译（摘要部分）
癌症仍是全球肿瘤学面临的严峻挑战，传统治疗往往难以在晚期阶段获得持久应答。过继性细胞疗法（adoptive cell therapy, ACT）尽管在血液系统恶性肿瘤中取得了革命性成功，但在实体瘤中仍面临关键瓶颈，包括不利的免疫抑制性肿瘤
中文翻译（摘要部分）
癌症仍是全球肿瘤学面临的严峻挑战，传统治疗往往难以在晚期阶段获得持久应答。过继性细胞疗法（adoptive cell therapy, ACT）尽管在血液系统恶性肿瘤中取得了革命性成功，但在实体瘤中仍面临关键瓶颈，包括不利的免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）、受限的细胞迁移以及T细胞耗竭的快速发生。本综述系统探讨了ACT平台的发展演变，涵盖从基础肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TILs）到精准工程化嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）-T及T细胞受体（T-cell receptor, TCR）-T疗法。研究人员重点阐述了如何通过创新工程策略，如整合“装甲型”CAR（armored CARs）、合成基因电路（synthetic gene circuits）以及CRISPR/Cas9介导的基因编辑，来增强效应细胞的持久性与多功能性。在T细胞中心策略之外，研究人员还审视了多种免疫效应细胞的新兴格局，包括CAR-自然杀伤细胞（CAR-natural killer, CAR-NK）及CAR-巨噬细胞（CAR-macrophage, CAR-M），这些细胞在抗原识别与安全性方面具有独特优势。此外，研究人员详细阐述了多模式联合方案的协同潜力，即ACT与免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）、局部放疗或基于纳米技术的递送系统相结合，以瓦解TME屏障并实现系统性抗肿瘤免疫。通过追踪治疗细胞从体外扩增到瘤内浸润及细胞毒作用的旅程，本综述阐明了决定治疗效果的分子机制。最后，研究人员讨论了当前临床试验格局、生产制造障碍以及将这些复杂细胞产品从实验室推向临床所必需的监管路径。
主体内容总结
ACT的发展与演变
细胞免疫治疗的基础可追溯至40余年前，最初通过在外周血淋巴细胞培养中加入纯重组白细胞介素-2（Interleukin-2, IL-2）生成淋巴因子激活杀伤细胞（lymphokine-activated killer, LAK）。LAK细胞在体外表现出优于自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤细胞毒作用。LAK细胞联合重组IL-2系统给药于转移性癌症患者，获得了持久的客观应答。随后研究团队利用IL-2扩增的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TILs），其在小鼠微转移模型中展现出比LAK细胞高50倍以上的细胞毒作用，自体TILs联合IL-2系统给药在转移性黑色素瘤中取得了显著疗效。TIL和LAK细胞疗法构成第一代ACT，缺乏特异性靶向和杀伤能力，仅对少数癌症患者有效，且高剂量IL-2的肝、肾毒性限制了其临床广泛应用。
这些局限推动了下一代ACT的发展。自1980年以来基因工程技术的快速进步催生了将嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）整合入自体细胞毒性T淋巴细胞的新方法，产生了第一代CAR-T疗法。然而，第一代CAR-T细胞因增殖能力差和细胞因子分泌不足，临床结果不佳。21世纪初，共刺激因子的重要性被认识，共刺激结构域被引入CAR结构，发展出第二代CAR。一系列针对造血系统恶性肿瘤的临床试验取得了积极结果，2017年tisagenlecleucel获FDA批准用于治疗复发或难治性滤泡淋巴瘤。1987年，Kuwana等人将嵌合受体蛋白与T细胞受体（T-cell receptor, TCR）恒定区结合，增强了T细胞在特异性抗原激活后的杀伤能力。除CAR-T外，工程化TCR-T疗法及新型CAR武装效应免疫细胞成为ACT的新策略。2022年，Tebentafusp获FDA批准，成为首个商业化TCR疗法，这是一种双特异性蛋白，具有高亲和力可溶性TCR片段和抗CD3免疫效应结构域，可特异性靶向gp100，用于不可切除或转移性葡萄膜黑色素瘤。靶向HER2的CAR-M在小鼠乳腺癌模型中显示出特异性吞噬能力。CAR-NK细胞可通过CD16介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用消除肿瘤细胞。此外，治疗性癌症疫苗（therapeutic cancer vaccines, TCVs）在临床中广泛研究，旨在启动或增强CTL介导的肿瘤抗原特异性免疫应答，但历史上多项关键TCV临床试验未能显示明确的临床获益，归因于免疫抑制性TME和次优的肿瘤抗原。当前基于个体化新抗原的TCV及新型联合策略正在蓬勃发展。
改善ACT在实体瘤中性能的工程转导策略
实体瘤中ACT的主要障碍包括持久性不足、免疫抑制微环境中的功能失调激活、肿瘤迁移效率低下、抗原异质性以及靶向/脱靶毒性。转导作为克服这些障碍的工程工具被讨论。
通过稳定转导维持持久性和多功能性
当转移细胞需要扩增、持久存在并反复与肿瘤细胞接触时，需要持久的受体表达。慢病毒载体（lentiviral vectors, LVs）和γ-逆转录病毒载体主要用于体外生成稳定的CAR-T和TCR-T产品。LV转导的主要优势在于能够在细胞扩增后维持多基因程序：CAR可与IL-12、IL-15或IL-18、检查点抵抗模块、自杀开关或趋化因子受体结合，创建装甲型、安全可控或迁移增强的细胞。稳定转导可将肿瘤识别与持续细胞因子支持、抑制信号抵抗和改善归巢相结合。但永久性也固定了任何非预期表型，多顺反子装甲构建可能降低载体产量和转导效率，载体拷贝数、插入位点、复制感受态病毒、效力和长期克隆行为需要产品级控制。
通过瞬时和可逆受体表达降低毒性
当肿瘤相关抗原也在健康组织中低水平表达时，永久性CAR表达可能延长靶向/脱靶损伤。信使RNA电穿孔提供快速、非整合的受体表达，随RNA降解和细胞分裂而衰减。这种可逆形式适用于首次人体剂量探索、安全窗口不确定的靶点以及活性应停止而不消除输注细胞的设计。其权衡是异质性表达、有限持久性和需要重复给药。脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）通过递送CAR mRNA或编辑货物而不进行基因组整合来扩展这一安全逻辑。LNP介导的CAR编程是瞬时的，受体表达下降可缩短正常组织被识别时的毒性持续时间，并允许逐剂量控制。靶向可电离LNPs已在临床前研究中在选定免疫细胞群体中产生瞬时CAR表达，但免疫细胞趋向性、内体逃逸、先天免疫激活、脱靶转染和可变表达目前限制了临床转化。
通过精准基因组编辑改善抵抗力和产品均一性
某些实体瘤限制需要修饰内源位点而非添加另一组成型转基因。Cas9引导RNA核糖核蛋白电穿孔可瞬时破坏PDCD1或CISH等抑制通路，而AAV供体模板可支持将CAR或TCR靶向插入TRAC等位点。这些应用可改善对抑制信号的抵抗、减少可变受体表达和强直信号、替换内源TCR或促进标准化同种异体产品。精准编辑并不消除安全性测试需求。多重编辑可产生脱靶变化、靶向大片段缺失、易位或细胞适应性丧失，靶向插入可能受供体大小和编辑效率限制。该方法最适用于特定基因组变化提供瞬时表达无法实现的机制优势，且基因组完整性和表型可纳入放行检测。
实现可扩展制造和体内免疫细胞编程
体外激活、转导、扩增和放行检测增加了成本和静脉到静脉时间。靶向LNPs和特定场景下的病毒载体正被开发用于直接体内编程T细胞、NK细胞或巨噬细胞，可能避免个体化细胞制造并支持重复给药。工程目标不仅是非病毒递送，而是选择性进入目标免疫细胞亚群并具有足够货物表达以产生治疗群体。目前，生物分布、细胞特异性、剂量依赖性炎症和脱靶编程控制仍是决定性障碍，体内转导应被视为已确立的体外ACT的新兴补充。平台选择应从所需治疗行为开始：LV或逆转录病毒转导适用于持久CAR/TCR表达和稳定装甲程序；mRNA电穿孔或LNP递送在需要可逆受体表达以限制毒性时更优；瞬时RNP编辑（必要时加供体模板）适用于检查点破坏或位点特异性受体插入。混合产品可组合这些策略，前提是每层针对明确的实体瘤屏障并增加可衡量的获益以证明其制造和安全负担合理。
过继性细胞疗法
癌症细胞疗法的临床格局以快速流动性为特征，大量试验评估多种恶性肿瘤中的不同治疗模式。阐明这些生物技术突破向临床工作流程的转化，对于揭示将此类先进细胞产品推向临床所固有的多方面障碍和战略前景至关重要。
基于CAR的疗法
嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）是一种合成分子，由胞外、跨膜和胞内结构域组成。与T细胞受体不同，CAR无需MHC呈递即可直接结合肿瘤细胞抗原，避免了通过MHC下调实现的肿瘤逃逸。一旦结合靶标，CAR转导激活和共刺激信号，导致T细胞增殖、细胞因子释放以及穿孔素或颗粒酶释放等细胞毒活性。
CAR-T
CAR-T疗法是一种ACT，即收集患者免疫细胞，在体外扩增和基因工程改造后回输，以增强其识别和消除肿瘤细胞的能力。CAR的发展始于scFv、铰链和CD3ζ信号结构域的组合，即第一代CAR。CD3ζ结构域足以激活细胞毒性，但不足以引起显著增殖或持久性。第二代和第三代通过添加单一共刺激结构域（最常见为CD28或4-1BB）克服了这一缺陷，增强了扩增和存活，构成临床获批产品的基础。第四代“装甲型CAR”或TRUCKs添加了允许细胞因子分泌（如IL-12）或免疫调节分子表达的遗传元件。第五代添加了细胞因子受体信号基序，如缩短的IL-2Rβ结构域与STAT3/5结合位点组合，使CAR-T细胞能够响应抗原识别直接参与JAK-STAT通路。2010年Carl June首次将CAR-T用于慢性淋巴细胞白血病患者，靶向CD19的CAR-T细胞注射后实现完全缓解。2013年Grupp等人发现CD19靶向CAR-T在两名复发、化疗难治性B细胞ALL儿童中诱导完全缓解。此后CAR-T临床试验迅速增加。
CAR-T在实体瘤中的应用
CAR-T在实体瘤中的应用面临显著挑战。与ALL和弥漫大B细胞淋巴瘤不同，实体瘤以TAA表达高度异质性、靶向/脱靶毒性风险增加和高度免疫抑制性TME为特征。在临床最先进的靶点中，CLDN18.2在胃癌和胃食管交界癌中成为特别有前景的抗原。CT041（satri-cel）的早期研究在重度预处理的胃肠道恶性肿瘤中显示出令人鼓舞的活性。随机、开放标签II期CT041-ST-01试验验证了这些发现，satri-cel显著延长中位无进展生存期（3.25 vs. 1.77个月；HR 0.37，95% CI 0.24–0.56；P<0.0001），客观缓解率约22% vs. 4%，中位总生存期分别为7.92个月和5.49个月。细胞因子释放综合征频繁发生但主要为1-2级。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3, GPC3）在大多数肝细胞癌中异常过表达。靶向GPC3的CAR-T在Child-Pugh A HCC患者中6个月OS率为50.3%，中位OS为278天。IL-15武装的GPC3 CAR-T细胞增强了扩增、持久性和临床获益，三分之二患者实现疾病控制。C-CAR031是武装显性负性转化生长因子-β受体II（dnTGFβRII）的GPC3特异性CAR-T产品，在36名晚期难治性HCC患者中，32名观察到肿瘤消退，ORR为44.4%，中位缓解持续时间为4.4个月，mPFS和mOS分别为4.2和14.2个月。靶向GUCY2C、IL-13Rα2、B7-H3和CD70的临床研究提供了概念验证证据。GD2靶向CAR-T在复发/难治高危神经母细胞瘤中，3年OS和EFS分别为60%和36%。GUCY2C靶向CAR-T在转移性CRC中，19名可评估患者ORR为26.3%，中高表达患者ORR达50.0%，mPFS为9.0个月。IL-13Rα2靶向CAR-T在高级别胶质瘤中显示前景，CRISPR工程化同种异体CAR-T联合鞘内给药进一步展示了基因组编辑与局部区域递送的整合潜力。CD70靶向同种异体CAR-T在晚期透明细胞肾细胞癌中实现持久疾病控制。
CAR-T的挑战
脱靶和抗原逃逸是核心障碍。缺乏具有足够治疗窗口的肿瘤特异性抗原，HER2等靶点在正常组织也有表达，导致早期试验中致命或剂量限制性靶向/脱靶毒性。抗原逃逸是复发的主要机制，肿瘤细胞可下调或剪接掉靶抗原、分泌可溶性抗原作为诱饵或发生谱系转换。吞噬作用（trogocytosis）中肿瘤细胞从T细胞获取CAR分子可加速免疫逃逸。难以浸润方面，实体瘤形成物理和生化屏障：异常血管、致密细胞外基质和错配趋化因子梯度限制迁移。工程策略如乙酰肝素酶表达CAR-T细胞或趋化因子受体重定向（CCR2b、CXCR1/2）在临床前模型中改善瘤内浸润，但缺乏稳健临床验证。T细胞耗竭和缺氧、营养耗竭TME中的代谢应激限制持久性和长期肿瘤控制。安全性方面，CRS和ICANS的标准化分级和管理改善了急性死亡率，但延迟或持久性血细胞减少（ICAHT）和噬血细胞综合征样毒性（IEC-HS）仍具有临床意义。2024年底FDA和EMA对CD19和BCMA CAR-T产品强制黑框警告，提及罕见的CAR-T相关T细胞淋巴瘤或白血病，建议终身监测。CAR结构本身的免疫原性也限制再治疗和持久性，鼠源scFv可引发抗CAR抗体。实际问题上，自体CAR-T产品需要约4-6周静脉到静脉时间，快速进展患者可能恶化。美国获批CAR-T产品每次输注标价465,000至633,000美元，不包括住院、ICU、免疫球蛋白替代和延长随访，高费用仍是广泛使用的障碍。
CAR-M
为什么选择CAR-M？
巨噬细胞是具有天然肿瘤归巢能力和内在吞噬功能的先天免疫细胞。CAR工程化巨噬细胞可浸润实体瘤、直接吞噬肿瘤细胞、重塑TME并为适应性免疫呈递抗原。
CAR-M的机制基础
CAR-M具有增强的吞噬能力，抗原识别后直接吞噬和降解肿瘤细胞。通过抗原加工和呈递，CAR-M可招募内源T细胞并将免疫识别扩展到原始靶抗原，即“抗原扩散”。CAR-M可维持或支持M1样炎症状态，以促炎细胞因子分泌和效应淋巴细胞浸润促进为特征。
CAR-M的突破
在一项HER2阳性实体瘤（包括乳腺癌、胃食管癌和唾液腺导管癌）的I期临床试验中，CT-0508（HER2靶向CAR-M）在14名患者中，4名达到RECIST v.1.1标准的最佳总体缓解为疾病稳定，中位PFS为1.47个月，未观察到剂量限制性毒性。组织学和免疫组化评估显示肿瘤病灶内CD3?和CD8? T细胞浸润增加，CD68和HLA-DR等巨噬细胞活化标志物上调。转录组分析富集促炎和免疫刺激基因特征，包括干扰素-γ、TNFα、IL-12信号以及抗原呈递和趋化因子介导T细胞招募通路。在临床前HER2阳性实体瘤模型中，CAR-M单药适度延缓肿瘤生长，PD-1阻断单药效果有限，联合治疗产生协同活性，实现60-70%肿瘤缩小，部分完全消退，中位生存期延长两倍以上。
CAR-M的挑战
巨噬细胞高度可塑，可能在TME影响下恢复为免疫抑制性M2样表型。巨噬细胞倾向于滞留在肺、肝和肾，仅少数CAR-M到达靶组织。腹腔注射可减少非预期聚集并富集于肿瘤，但引发安全性担忧。CAR-M过度激活可能带来不受控制的局部或全身炎症风险，如CRS、神经毒性和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH）。巨噬细胞是终末分化细胞，难以体外扩增，临床生产主要依赖外周血单核细胞，限制可扩展性。巨噬细胞对稳定遗传修饰具有抵抗性，腺病毒载体和非病毒系统如LNPs可实现瞬时表达，但持久CAR整合仍难实现。体内持久性限于数天至数周，可能需要重复给药。
CAR-M的前景
iPSC来源巨噬细胞（iMacs）提供可再生、可扩展的巨噬细胞来源，具有更高遗传可操作性及标准化、库存储制造的潜力。iPSC来源CAR-巨噬细胞可保留巨噬细胞样吞噬功能并展现抗原依赖性抗肿瘤活性。补充策略是从体外制造转向体内CAR-M工程，通过靶向病毒载体、LNPs、工程生物材料或生物指导支架将CAR编码遗传货物直接递送至内源巨噬细胞。这可能简化制造、减少患者特异性处理并在TME内直接生成CAR表达巨噬细胞。但细胞类型特异性递送、转基因表达控制、脱靶修饰、巨噬细胞极化和体内工程可逆性仍是主要转化挑战。未来CAR-M发展可能涉及两个互补方向：标准化iPSC来源CAR-M产品实现可扩展和可重复制造，以及体内CAR-M工程绕过常规体外细胞生产的若干瓶颈。
基于CAR技术的新型细胞疗法（CAR-NK、CAR-γδT、CAR-NKT）
CAR-NK疗法
自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统的第一响应者。CAR-NK疗法将CAR特异性与NK细胞固有杀伤能力结合，可杀死CAR靶向抗原和肿瘤细胞上的额外应激配体，这对处理抗原丢失很重要。CAR-NK具有良好安全性，产生与CRS和神经毒性相关的独特细胞因子谱，缺乏同种异体反应性，不引起移植物抗宿主病（GvHD）。使用供体细胞可大规模制造、储存于细胞库并即时可用，降低成本。CAR-NK细胞体内持久性短，需工程解决方案，如武装IL-15支持增殖和活性，但非调控表达导致全身毒性，需开发受控诱导表达系统。CRISPR-Cas9基因编辑用于敲除NKG2A和TGFBR2等抑制基因，增强细胞毒性和在恶劣TME中发挥功能的能力。
CAR-γδT疗法
γδT细胞携带T细胞受体但以先天免疫细胞的速度和MHC非依赖识别运作，可直接识别肿瘤细胞上的应激信号或脂质抗原，无需抗原呈递。这种MHC非依赖识别允许靶向已下调MHC分子的肿瘤。通过CAR和天然受体的双重杀伤能力提供更全面对抗肿瘤异质性的方法。这些细胞具有迁移至上皮和粘膜组织的天然倾向，在治疗源自这些部位的实体瘤方面具有天然优势。然而，肿瘤内γδT细胞常因TME通过免疫检查点施加的抑制而耗竭和失活，免疫检查点抑制剂（ICIs）可激活γδT细胞。主要障碍包括外周血γδT细胞供应有限，需要稳健可扩展的制造方法。用于体外扩增的常见激动剂如氨基双膦酸盐在患者中显示次优药代动力学特征和潜在脱靶效应。
CAR-NKT疗法
恒定自然杀伤T（iNKT）细胞是独特的淋巴细胞亚群，在免疫调节中发挥重要作用。
