《Italian Journal of Pediatrics》：Can mesenchymal stem cell and retinoic acid therapies more effectively reduce lung damage due to bronchopulmonary dysplasia?
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目的：本研究旨在评估维甲酸（RA）联合间充质干细胞（MSCs）治疗相较于单独使用MSCs对支气管肺发育不良所致肺损伤的疗效。
方法：研究使用了出生后第3天的29只Wistar新生大鼠。实验于幼鼠出生后第3天开始，持续至出生后第14天。利用有机玻璃舱建
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目的：本研究旨在评估维甲酸（RA）联合间充质干细胞（MSCs）治疗相较于单独使用MSCs对支气管肺发育不良所致肺损伤的疗效。
方法：研究使用了出生后第3天的29只Wistar新生大鼠。实验于幼鼠出生后第3天开始，持续至出生后第14天。利用有机玻璃舱建立高氧系统。骨髓来源干细胞（1×10?）经腹腔注射给药。维甲酸（500 mcg/kg）自出生后第3天起每日经腹腔注射，持续至出生后第13天。研究进行了形态计量学分析和组织学分析，以对肺结构变化进行更详细的评估。为评估纤维化，采用Masson三色染色法显示肺切片中的胶原沉积。通过免疫组织化学和免疫荧光染色评估α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。
结果：高氧显著损害肺结构，表现为与对照组相比，平均线性截距（MLI）、肺泡大小和血管壁厚度增加，以及肺泡组织分布减少（p＜0.0001）。与高氧组相比，间充质干细胞（MSCs）治疗显著改善了这些参数（p＜0.0001）。值得注意的是，MSCs+维甲酸（RA）联合治疗带来了进一步改善，其形态计量学结果接近对照组水平。此外，高氧组中显著升高的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达（p＜0.0001）在两个治疗组中均有所降低，其中MSCs+RA组的降低最为显著。
结论：联合治疗显著减少了BPD模型中的纤维化和炎症，且两种疗法联合使用取得了最佳改善效果。
论文解读
一、研究背景与意义
支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）是一种以需要机械通气和氧疗为特征的慢性肺部疾病，其病理特点包括肺生长受限、肺泡和血管发育障碍以及肺功能受损。尽管新生儿医学不断进步，BPD仍然是高死亡率和发病率的重要疾病。高氧暴露和机械通气会触发肺部促炎反应，释放自由基，导致肺泡结构破坏，表现为肺泡数量减少、结构简化、气体交换面积减小，同时伴随肺泡间隔纤维化和气道平滑肌轻度增厚。
目前BPD的治疗手段有限，主要包括咖啡因、维生素A和地塞米松等中等活性药物，但长期使用特别是产后皮质类固醇与严重的神经发育不良结局相关。维生素A及其活性代谢产物维甲酸（retinoic acid, RA）在肺分支和发育中发挥重要作用，参与呼吸道上皮细胞的分化，对极低出生体重儿给予维生素A可降低BPD发生率。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）在动物模型中的研究显示，经静脉、腹腔或气管内给予MSCs可减轻新生鼠高氧肺损伤，表现为肺部炎症减轻、血管损伤和肺泡发育停滞的避免以及肺纤维化的抑制。然而，单一疗法的效果仍有限，研究人员假设两种有效疗法的联合应用可能产生更优效果，并围绕这一概念设计了本研究。该研究是文献中首次在新生高氧模型中联合使用维甲酸和MSCs治疗。
二、研究设计与方法概述
本研究使用29只出生后第3天的Wistar新生大鼠，来源于Dokuz Eylül大学医学院动物实验研究单位，经该大学动物实验地方伦理委员会批准（批准号：2021/011）。实验自出生后第3天开始至第14天结束，通过有机玻璃舱建立氧浓度≥90%的高氧系统。研究分为四组：正常对照组（NC，n=5，室内空气）、高氧对照组（HC，n=8，BPD模型+腹腔生理盐水）、MSCs治疗组（n=8，BPD模型+腹腔MSCs+生理盐水）、MSCs+RA联合治疗组（n=8，BPD模型+腹腔MSCs+RA 500 mcg/kg）。骨髓来源MSCs（1×10?）于出生后第3天单次腹腔注射，RA每日腹腔注射至第13天。动物于出生后第21天处以安乐死。研究采用的主要技术方法包括：苏木精-伊红（H&E）染色进行组织学评估；形态计量学分析（平均线性截距MLI、肺泡组织分布、肺泡大小、血管壁厚度）；Masson三色（MT）染色评估胶原沉积；免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）染色评估α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达水平。
三、研究结果
（一）MSCs和维甲酸治疗减轻了BPD引起的肺形态学改变
通过H&E染色观察，对照组呈现规则的细小肺泡结构，而高氧组（HC）肺结构紊乱、肺泡显著增大且分布不均。接受MSCs治疗的组别中，增大的肺泡分布减少，而MSCs+RA组则呈现与健康对照组相似的规则肺泡结构。形态计量学分析显示，与对照组相比，高氧组的MLI、肺泡大小和血管壁厚度显著升高，而肺泡组织分布显著降低（p＜0.0001）。与HC组相比，MSCs组和MSCs+RA组的MLI、肺泡大小和血管壁厚度参数均显著降低（p＜0.0001）。进一步分析显示，MSCs+RA组的高氧诱导肺损伤改善最为显著，接近对照组水平，提示联合治疗可能更为有效。Masson三色染色评估胶原沉积显示，MSCs+RA组的胶原水平降低极为显著，表明联合治疗显著预防了胶原沉积所致的肺纤维化。
（二）高氧暴露大鼠肺中高表达的α-SMA被MSCs和维甲酸治疗抑制
免疫组织化学染色显示，HC组中代表α-SMA表达的深棕色区域更为密集，而治疗组的α-SMA表达较HC组减少。免疫荧光染色及Image J定量分析结果与IHC一致：α-SMA荧光强度在HC组显著高于NC组（p＜0.0001），治疗组α-SMA表达水平低于HC组，且所有组间α-SMA表达均存在统计学显著差异。综合结果表明，MSCs和MSCs+RA治疗均能降低与肺纤维化相关的α-SMA表达。
四、讨论与结论
本研究表明，MSCs治疗可显著改善高氧诱导的肺损伤，而MSCs与RA联合使用产生了更显著的保护效应，具体表现为肺泡结构、形态计量参数和纤维化相关α-SMA表达的改善，提示联合治疗可能具有叠加或协同效应。MSCs具有低免疫原性，可体外扩增和冻存，通过免疫调节、血管生成、组织修复等机制发挥治疗作用。RA在肺发育中通过激活维甲酸受体（RARs）和维甲酸X受体（RXRs）调控肺泡化和上皮细胞分化相关基因表达，可能通过促进间隔形成和上皮再生参与肺泡结构恢复。
研究存在若干局限性：首先，该研究为动物实验模型，结果不能直接外推至人类新生儿；其次，MSCs和RA均经腹腔途径给药，可能并非肺靶向治疗的最有效递送方式，临床转化应谨慎解读，未来需比较不同给药途径；第三，样本量相对较小；最后，治疗效应的分子机制尚未充分研究。从转化角度看，早期干预可能比较晚给药更为有益，但该研究结果支持早期联合治疗的合理性，而非直接推荐固定临床方案。
结论：据研究人员所知，这是首项在新生高氧模型中评估MSCs和RA联合使用的研究。结果表明，联合治疗可能比单一治疗带来更大获益。联合治疗显著减少了BPD模型中的纤维化和炎症，两种疗法联合使用取得了最佳改善效果。该研究结果提示，以RA-MSCs联合使用替代单独使用维甲酸可能对临床实践具有指导意义。
