内皮FoxO1的雌性特异性依赖决定肥胖状态下血管韧性与代谢适应

《Angiogenesis》：Female-specific reliance on endothelial FoxO1 governs vascular resilience and metabolic adaptation to obesity

　　

脂肪组织血管重塑的性别差异显著影响肥胖相关代谢病的易感性，但其机制尚不清楚。研究人员在此鉴定出叉头框蛋白O1（Forkhead box O1, FoxO1）为内皮功能的性别依赖调节因子；雌性内皮细胞（endothelial cells, EC）表达更高水平的FoxO1，并依赖其维持血管重塑和代谢稳态。因此，雌性中FoxO1缺失破坏血管生成（angiogenesis），促进脂肪细胞肥大（adipocyte hypertrophy）、体重增加和葡萄糖调节异常（glucose dysregulation），而雄性中则报道了相反效应。该表型与内皮转录组（endothelial transcriptome）向雄性样状态转变相关，符合雌性对饮食诱导的代谢功能障碍（diet-induced metabolic dysfunction）保护作用丧失。机制上，FoxO1抑制呈时间依赖效应：短期抑制促进增殖，持续抑制降低增殖并诱导代谢功能障碍。尽管雄性中也观察到这些效应，但雌性EC中更明显；雌性EC还选择性表现线粒体功能障碍（mitochondrial dysfunction）、氧化应激（oxidative stress）增加和DNA损伤积累（DNA damage accumulation），最终导致衰老样停滞（senescence-like arrest）。抗氧化治疗（antioxidant treatment）部分挽救该表型，提示氧化应激是雌性特异性易感性的驱动因素。这些发现揭示FoxO1功能的性别依赖差异，并确定内皮FoxO1是致肥胖应激（obesogenic stress）下相反血管和代谢反应的决定因素。

研究背景与目的：白色脂肪组织（white adipose tissue, WAT）在营养过剩时扩张，内脏脂肪适应不良是心血管代谢病的重要风险因素。生物性别影响内脏WAT形成与功能，雌性在同等肥胖程度下通常保留更健康的脂肪组织并较少发生代谢紊乱；血管生成对生理性而非适应不良性脂肪扩张具有关键作用。雄性高脂饮食（high-fat diet, HFD）下内脏WAT血管生成受抑，而雌性保留较强血管生成能力，但性别特异血管生成能力的分子机制尚未解决。内皮细胞（endothelial cells, EC）构成脂肪微血管，代谢应激诱导的内皮功能障碍是肥胖血管生成反应受损的重要因素。叉头框蛋白O1（Forkhead box O1, FoxO1）是EC生物学关键调节因子，成年内皮中可通过抑制增殖和糖酵解维持静息；长期HFD增加内皮FoxO1，雄性内皮特异性FoxO1缺失增强血管生成并防止饮食诱导代谢功能障碍。然而这些证据多来自雄性模型或性别未定系统；雌性脂肪EC虽FoxO1表达更高，却表现更强增殖能力和应激韧性，提示FoxO1在雌性可能具有不同作用。研究人员因此检验FoxO1维持雌性内皮韧性假说。该论文发表于《Angiogenesis》。研究结论表明，FoxO1是雌性EC韧性关键决定因素，其缺失导致雌性特异性代谢应激易感，揭示FoxO1功能的性别差异，并为理解血管衰老和疾病易感性的性别差异提供见解。

主要关键技术方法：研究人员采用他莫昔芬诱导的内皮细胞特异性Pdgfb-iCreERT2:Foxo1^f/f小鼠（EC-FoxO1 KD），并以Rosa26-mT/mG报告验证内皮特异性；雌雄对照接受低脂饮食（low-fat diet, LFD）或HFD 4、7、16周。分离脂肪EC进行qPCR、Western blot和叉头反应元件（forkhead response element, FRE）-荧光素酶活性检测；7周HFD后进行RNA-seq（n=4/组）及EdU掺入/免疫染色；开展胰岛素耐量试验（insulin tolerance test, ITT）和葡萄糖耐量试验（glucose tolerance test, GTT）；原代培养小鼠脂肪EC并以AS1842856、Foxo1 siRNA、N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）和RepSox处理；Seahorse检测ATP产生速率；并分析人皮下脂肪血管细胞图谱（68,503个血管细胞，65名供者）的FOXO1表达。

研究结果：
1. 雌性内皮细胞中FoxO1水平与活性高于雄性。标准饲料小鼠新鲜分离脂肪EC中，雌性Foxo1 mRNA约为雄性2倍；培养EC中FoxO1蛋白和FRE-荧光素酶活性更高；人皮下脂肪血管细胞图谱显示Sub-EC中FOXO1表达最高，非肥胖女性高于男性，提示稳定细胞内在差异。
2. 内皮细胞特异性FoxO1敲低破坏HFD雌性小鼠血管生成并驱动脂肪功能障碍。16周HFD下，雌性EC-FoxO1 KD小鼠体重增加加速、WAT质量增加、pWAT脂肪细胞肥大约1.7倍；毛细血管密度在7周和16周降低，Vegfa转录无差异，毛细血管直径增大并出现异常形态，Itgax升高；与雄性相反。
3. 雌性EC-FoxO1敲低降低其他代谢组织毛细血管化并扰乱全身葡萄糖代谢。16周HFD雌性EC-FoxO1 KD小鼠棕色脂肪组织（brown adipose tissue, BAT）内皮标志Pecam1、Cdh5、Tie1和Ucp1降低，骨骼肌毛细血管/肌纤维比降低约18%，空腹血糖升高、胰岛素敏感性降低、糖耐量轻度受损；与雄性报道相反。
4. 内皮细胞FoxO1缺失在LFD条件下也破坏雌性血管含量与代谢稳态。16周LFD雌性EC-FoxO1 KD小鼠体重轻度增加，pWAT脂肪细胞肥大、Itgax升高、毛细血管数降低约1.6倍、毛细血管直径增大2.8倍，>20 μm毛细血管比例约12%（雄性<4%）；BAT内皮标志和Ucp1降低，骨骼肌毛细血管减少，胰岛素敏感性受损，短时空腹血糖升高而糖耐量不受影响，提示饮食非依赖性血管表型。
5. FoxO1敲低诱导EC转录组出现性别偏倚及功能障碍性转变。7周HFD脂肪EC RNA-seq显示雌性约1,300个、雄性1,006个差异表达基因（differentially expressed genes, DEG）；主成分分析显示雌性EC-FoxO1 KD向雄性对照偏移；基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示雌性通路扰动更广，增殖、细胞呼吸、核小体组织和DNA修复受抑，超氧化物代谢和内皮细胞衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）诱导；体内EdU显示仅雌性KD EC增殖降低，提示FoxO1维持雌性EC复制。
6. FoxO1抑制在培养脂肪EC中诱导时间依赖、性别特异的促增殖向抗增殖转换。AS1842856短期1天抑制使两性Mki67和EdU增加；6天持续抑制使雌性EdU降低、雄性仍高但幅度降低；雌性3天即出现抗增殖，p21^Cip1核积累；Foxo1 siRNA增加雌性Tgfb1，pSmad2核水平升高，但RepSox未恢复反而抑制增殖，提示p21依赖、TGFβ非依赖机制。
7. FoxO1抑制选择性损害雌性EC线粒体能量产生并促进氧化应激。Seahorse显示1天抑制后雄性总ATP增加而雌性不增加，两性糖酵解ATP增加，雌性线粒体ATP选择性降低；6天抑制后雌性总ATP和线粒体ATP受损，雄性无差异；雌性线粒体网络长度选择性缩短，雄性增加，Mfn2和Fis1 mRNA未变，提示雌性EC对FoxO1抑制的线粒体完整性易感。
8. FoxO1抑制选择性诱导雌性EC氧化应激与DNA损伤。6天抑制后4-羟基壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal, 4-HNE）在雌性增加至雄性水平，雄性不变；抗氧化基因Prdx3和Gpx8两性上调；γH2AX焦点仅雌性增加；p53核水平两性升高，Gadd45a仅雄性诱导，提示雌性氧化应激增加且DNA修复反应减弱。
9. 持续FoxO1抑制在雌性EC中选择性诱导活性氧（reactive oxygen species, ROS）依赖的衰老样表型。6天抑制后雌性核面积增加并与γH2AX焦点相关，p16^INK4a核水平和阳性率增加；9天抑制后撤药3天仅雄性恢复增殖；NAC共处理改善雌性增殖、防止核增大并降低p16^INK4a，提示ROS驱动该表型。

讨论与结论：讨论指出，FoxO1是雌性EC韧性关键因子，可维持线粒体完整性、氧化还原平衡和基因组稳定性；持续FoxO1缺失或抑制可能通过累积代谢应激、氧化损伤和复制耗竭导致增殖停滞。雌性EC较高线粒体含量和氧化代谢可能使其更易发生线粒体功能障碍；NAC部分挽救支持ROS驱动作用。研究强化了脂肪和骨骼肌血管化对肥胖相关代谢功能障碍的因果贡献，但也不能排除EC衰老样状态对全身稳态的直接作用。研究结论部分翻译：总之，该研究揭示了EC生物学中FoxO1的性别偏倚需求。与既往将FoxO1主要描述为内皮增殖抑制因子的研究不同，研究数据提示FoxO1是内皮应激韧性的性别特异调节因子，揭示了雌雄内皮间此前未被认识的FoxO1信号差异。雌性EC中FoxO1表达升高的基础尚待确定，但研究数据表明，在体内及培养EC中，雌性FoxO1缺失的后果加重且不依赖激素信号。雌性EC表现出更高的细胞内在FoxO1依赖，以维持线粒体完整性、基因组稳定性和抗衰老等基本细胞功能。因此，雌性内皮FoxO1缺失损害细胞韧性、损伤血管生成并破坏血管结构，最终导致不良代谢结局。这些观察支持FoxO1作为EC韧性、血管健康和全身代谢稳态的性别特异调节因子的模型。这些见解可能对理解血管衰老和疾病易感性的性别差异具有更广泛意义。