《Veterinary Research》：Two-component system VraSR senses host defense peptide PMAP-36 to promote Streptococcus suis pathogenicity through regulating accD expression
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猪链球菌（Streptococcus suis，S. suis）是一种重要的人畜共患病原菌，可在全球范围内引起人类和动物的严重感染。感染时，宿主先天免疫系统产生宿主防御肽（host defense peptides，HDPs）以抵抗猪链球菌入侵。PMAP-36
猪链球菌（Streptococcus suis，S. suis）是一种重要的人畜共患病原菌，可在全球范围内引起人类和动物的严重感染。感染时，宿主先天免疫系统产生宿主防御肽（host defense peptides，HDPs）以抵抗猪链球菌入侵。PMAP-36是一种猪源宿主防御肽，已被证实无法有效杀灭猪链球菌，提示该病原菌已进化出逃避PMAP-36介导的免疫防御的策略。然而，猪链球菌响应PMAP-36的具体机制仍不清楚。本研究发现，PMAP-36显著增强猪链球菌的黏附能力、细胞毒性及毒力基因表达。双组分系统（two-component system，TCS）VraSR对PMAP-36促进猪链球菌致病性至关重要。研究人员证实PMAP-36可直接结合传感器激酶VraS。进一步的转录组学分析揭示，VraSR感知PMAP-36后调控脂肪酸生物合成，其中关键基因accD在PMAP-36处理的ΔvraS和ΔvraR突变株中表达均显著下调。accD缺失可减弱猪链球菌体内致病性，包括细菌载量降低、器官损伤减轻及炎症反应减弱。此外，VraSR介导的accD表达对猪链球菌诱导的细胞毒性和炎症反应至关重要，因为vraS或vraR缺失因accD持续高表达而未能减少炎性细胞因子的产生。本研究揭示了VraSR响应宿主防御肽激活的毒力调控机制，为开发对抗猪链球菌感染的新策略提供了新见解。
论文解读
一、研究背景与研究意义
猪链球菌（Streptococcus suis，S. suis）是一种重要的人畜共患病原菌，可导致人类和多种动物发生严重感染，对养猪业造成重大经济损失，同时构成公共卫生威胁。宿主先天免疫系统在感染过程中会产生宿主防御肽（host defense peptides，HDPs），包括防御素和cathelicidin两大类，通过直接杀灭病原菌或调节免疫应答来发挥抗感染作用。然而，部分病原菌已进化出多种策略来抵抗宿主防御肽的杀伤，包括分泌蛋白酶降解宿主防御肽、携带获得性耐药基因、修饰细胞表面组分以减少宿主防御肽的结合与穿透，以及通过与细菌外膜蛋白互作促进生物被膜形成等。因此，阐明细菌逃避宿主防御肽的机制对于发现新型有效的抗菌靶点具有重要意义。
猪链球菌已被证实可通过多种方式逃避宿主免疫防御，如切割宿主防御肽、逃避吞噬杀伤、与补体因子互作以及抑制宿主氧化反应等。双组分系统（two-component system，TCS）作为响应外界环境刺激（包括宿主防御肽）的重要调控系统，在调节猪链球菌免疫逃逸和毒力中发挥关键作用。目前已鉴定出多种参与猪链球菌毒力或致病性的双组分系统，包括VraSR、NisKR、1910HK/RR、Ihk/Irr、CiaRH、SalK/SalR和VirR/VirS等。其中，VraSR是研究最为深入的双组分系统之一，参与多重耐药性，在对抗宿主防御肽中发挥关键作用。然而，激活VraSR系统的宿主来源信号仍不明确，其下游调控网络也有待进一步表征。前期研究已表明，猪源宿主防御肽PMAP-36无法有效杀灭猪链球菌，提示该病原菌能逃避其杀伤作用，但猪链球菌响应PMAP-36的具体机制尚不清楚。因此，本研究聚焦于宿主来源信号分子PMAP-36介导的猪链球菌致病性及其accD介导的脂肪酸代谢通路，旨在阐明其分子机制。
二、主要技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用同源重组技术构建基因敲除突变株（ΔvraS、ΔvraR、ΔaccD和ΔvraRΔaccD）；通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达水平；采用细胞热位移分析（CETSA）、药物亲和响应靶标稳定性分析（DARTS）和GST亲和分离实验验证蛋白-肽段直接相互作用；利用AlphaFold3预测蛋白结构并结合HDOCKlite进行分子对接及分子动力学模拟；开展转录组测序（RNA-seq）分析差异表达基因；通过小鼠感染模型评估体内致病性；采用ELISA检测炎性细胞因子水平。小鼠为C57BL/6野生型，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验经西南大学实验动物伦理委员会批准。
三、研究结果
1. PMAP-36刺激激活VraSR双组分系统
研究首先评估了PMAP-36对猪链球菌SC19株生长的影响，结果显示PMAP-36处理不损害细菌生长。通过RT-qPCR检测不同双组分系统基因表达发现，PMAP-36显著上调包括vraSR、salKR和virRS在内的多个双组分系统基因表达。进一步研究发现，PMAP-36增强SC19对人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）的黏附能力，显著上调荚膜多糖（CPS）合成基因（cps2B、cps2C、neuB、neuC）和黏附相关基因（strA、gdpP、ccpA、fbps）的表达，并增强对小鼠巨噬细胞的杀伤作用。这些结果表明PMAP-36促进细菌黏附和细胞毒性。
2. VraSR双组分系统感知PMAP-36调控猪链球菌黏附与细胞毒性
利用ΔvraS和ΔvraR突变株研究发现，单独敲除vraS或vraR不影响细菌生长，但PMAP-36处理延缓了突变株的生长。PMAP-36显著下调两个突变株中荚膜合成和黏附相关基因的表达。敲除vraS或vraR倾向于降低猪链球菌的黏附能力，且PMAP-36处理不再进一步改变突变株的黏附能力。一致地，敲除vraS和vraR显著减弱了对小鼠巨噬细胞的细胞毒性，PMAP-36处理对突变株的细胞毒性无额外影响。这些结果证明VraSR双组分系统是PMAP-36介导的荚膜/黏附基因表达、细菌黏附和细胞毒性增强所必需的。
3. VraS直接结合PMAP-36
通过表达纯化GST标签VraS蛋白，利用CETSA、DARTS和GST亲和分离实验验证PMAP-36与VraS的相互作用。CETSA结果显示PMAP-36提高了VraS的热稳定性，DARTS实验表明PMAP-36保护VraS免受蛋白酶消化，GST亲和分离实验显示FITC标记的PMAP-36与GST-VraS融合蛋白孵育时荧光强度显著增强，均证实PMAP-36与VraS直接结合。结构建模分析预测了VraS与PMAP-36的详细相互作用，结合自由能为-60.45 kcal/mol。分子动力学模拟显示PMAP-36-VraS复合物达到稳定构象状态，具有持续的氢键相互作用。这些结果证明VraS是PMAP-36的直接靶标。
4. VraSR双组分系统感知PMAP-36调控脂肪酸合成
转录组分析比较了PMAP-36处理下野生型、ΔvraS和ΔvraR菌株的基因表达谱。与PMAP-36处理的野生型相比，ΔvraS突变株有818个差异表达基因（DEGs），ΔvraR突变株有971个差异表达基因。KEGG通路富集分析显示，两个突变株中下调的差异基因主要富集于脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢、磷壁酸生物合成、双组分系统和氧化磷酸化通路。GO注释分析显示下调基因主要富集于转运、跨膜转运、转运蛋白活性和氨基酸生物合成。进一步验证发现，PMAP-36上调野生型菌株中脂肪酸合成基因（accD、fabZ、accB、fabF、fabG、fabD、B9H01_RS08650）和氧化应激响应基因（spx、nmlR、B9H01_RS04285）的表达，但在ΔvraS突变株中显著下调这些基因表达。其中accD是下调最显著的基因。在ΔvraR中，vraR缺失显著上调accD表达，但PMAP-36显著下调其表达，表明accD的转录调控依赖于VraR介导的信号通路。
5. accD缺失减弱猪链球菌在小鼠感染模型中的致病性
鉴于accD在VraSR缺陷菌株中表现出最显著的转录变化，且是脂肪酸生物合成的关键功能基因，研究人员构建了ΔaccD突变株评估其在体内致病性中的作用。accD缺失提高了小鼠存活率，显著降低了血液、肝脏、肺脏、肾脏和脑中的细菌载量，减少了IL-6和IL-1β的产生。组织病理学检查显示，野生型感染引起严重的器官损伤，包括间质性肺炎、肝索断裂、脾脏败血性炎症、肾小球充血和肾小管损伤等；而ΔaccD感染小鼠表现出明显减轻的病理变化，炎症评分显著降低。这些结果证明accD缺失降低猪链球菌体内致病性。
6. VraSR介导的accD表达调控猪链球菌细胞毒性和炎症反应
accD缺失不影响细菌生长，但上调荚膜合成基因（cps2B、cps2C、neuB、neuC）和部分黏附相关基因（strA、gdpP）的表达。ΔaccD菌株对hCMEC/D3细胞的黏附能力降低，PMAP-36轻微降低ΔaccD的黏附，表明PMAP-36以accD依赖方式促进细菌黏附。accD缺失显著降低猪链球菌诱导的巨噬细胞死亡以及IL-1β和IL-6的分泌。然而，vraS或vraR缺失未能减少细胞因子产生，仍保持与野生型相似的高水平。值得注意的是，ΔvraRΔaccD表现出显著降低的巨噬细胞死亡。这些结果证明VraSR介导的accD表达有助于猪链球菌诱导的细胞毒性和炎症反应。
四、讨论总结与研究结论
本研究揭示了猪源宿主防御肽PMAP-36作为VraSR双组分系统的上游激活信号，通过调控accD介导的脂肪酸代谢通路促进猪链球菌致病性的新机制。研究发现，PMAP-36直接结合传感器激酶VraS，激活VraSR系统，进而调控脂肪酸合成关键基因accD的表达，影响细菌黏附、荚膜合成、细胞毒性和炎症反应。与其他病原菌中宿主防御肽激活双组分系统的机制一致，如铜绿假单胞菌中LL-37被CprS感知、霍乱弧菌中LL-37和α-防御素5被CarS感知、金黄色葡萄球菌中LL-37激活GraRS系统，本研究首次鉴定猪源宿主防御肽PMAP-36为猪链球菌VraSR系统的上游激活信号，并表征accD介导的脂肪酸代谢通路为VraSR的新下游调控通路。
脂肪酸合成对细菌膜形成至关重要，是抗菌药物研发的潜在靶点。本研究表明accD缺失显著降低猪链球菌在小鼠感染模型中的致病性，包括降低死亡率、细菌载量和炎症反应。值得注意的是，accD缺失显著上调荚膜合成相关基因表达，提示脂肪酸生物合成受损和细胞膜稳态破坏后存在代偿性响应。PMAP-36介导的细菌黏附增强不仅依赖于解除荚膜对表面黏附素的遮蔽作用，VraSR可能还协调额外的下游调控级联反应正向调节细菌黏附。
研究结论：猪源宿主防御肽PMAP-36被猪链球菌VraSR双组分系统感知，进而调控脂肪酸合成关键基因accD的表达以促进细菌致病性。具体而言，accD敲除减弱了猪链球菌体内毒力、细菌黏附和宿主细胞膜损伤。该研究为靶向VraSR-accD通路作为预防或治疗猪链球菌感染的新策略提供了重要见解。
