《Current Oncology Reports》：Advances in Single-Cell and Spatial Omics for Glioblastoma Precision Medicine
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综述目的：胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成人中最具侵袭性和致命性的原发性恶性脑肿瘤，其特征为广泛的瘤内异质性及对周围脑组织的弥漫性浸润。尽管手术、放疗和化疗不断进步，患者预后仍较差，这凸显了提升生物学认知以指导精准医学潜在策略的迫切需求。
综述目的：胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成人中最具侵袭性和致命性的原发性恶性脑肿瘤，其特征为广泛的瘤内异质性及对周围脑组织的弥漫性浸润。尽管手术、放疗和化疗不断进步，患者预后仍较差，这凸显了提升生物学认知以指导精准医学潜在策略的迫切需求。尽管传统的批量基因组和转录组分析对理解GBM病理生理学做出了重要贡献，但此类跨细胞群体的平均分子信号掩盖了肿瘤微环境影响及具有临床意义的细胞状态。
近期发现：单细胞和空间组学技术的最新进展通过实现对肿瘤组成、细胞可塑性和空间组织的高分辨率分析，彻底改变了GBM研究。这些技术手段揭示了GBM由动态且可塑的细胞状态而非固定的分子亚型所构成，其中包括导致复发的干细胞样及治疗耐药性群体。空间分辨的转录组和蛋白质组方法保留了肿瘤结构，揭示了受肿瘤生态系统影响的区域性转录程序。这些发现为GBM演进和治疗耐药提供了更精细的视角，对现有分类系统提出了挑战。然而，在整合这些高维数据集、应对技术和计算需求以及将这些方法转化为临床可扩展的工作流程方面仍存在重大挑战，这些因素共同阻碍了其转化应用。
总结：本综述旨在综合GBM单细胞和空间组学的最新进展，批判性评估其在理解肿瘤异质性和肿瘤微环境相互作用方面的优势与局限。此外，本综述评估了GBM精准医学当前面临的挑战，并评价了这些技术在推进此类策略方面的潜力。
论文主体内容总结
引言
胶质母细胞瘤（GBM）是高度侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，以快速增殖和弥漫性浸润邻近脑实质为特征。确诊后中位生存期仅为14–16个月，五年总生存率（OS）约6.8%，尽管采用多模式标准治疗方案，预后仍然严峻。改善临床结局的重大障碍在于GBM广泛的细胞和代谢复杂性，肿瘤具有显著的固有生物学复杂性，涵盖瘤内及患者间异质性，这是驱动肿瘤进展、复发和治疗耐药的关键标志。通过空间不同区域活检已证实瘤内多样性，揭示肿瘤核心与周边之间存在显著差异。这种异质性使恶性细胞能够在肿瘤微环境（TME）内各种刺激作用下于不同细胞状态间转换，促进其在选择压力下的适应和存活。
GBM异质性的关键组成部分在于胶质瘤干细胞样群体的存在。这些干细胞样细胞通过产生构成肿瘤主体并表现出显著治疗耐药性的分化癌细胞亚克隆多样性后代，驱动肿瘤起始和维持。此外，TME内的动态相互作用对肿瘤演化和进展具有重要影响。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）等高新分辨率单细胞技术的进展已改变了GBM的转录组推断，揭示了胶质瘤内多样的细胞亚群，包括增殖性、干细胞样、间充质样、神经元样及免疫相关群体，各自对肿瘤生长、侵袭和治疗耐药做出独特贡献。尽管scRNA-seq在解析多样细胞群体方面显示出重要价值，但其无法提供空间背景信息，这凸显了将空间组学与scRNA-seq相结合的必要性，以在分子水平实现细胞相互作用和组织结构的可视化。
单细胞转录组学：揭示瘤内异质性
scRNA技术简介
单细胞测序技术于2009年由Tang等人首次引入，此后不断改进和发展，衍生出全长转录组分析、高通量和高灵敏度scRNA-seq。在GBM中，这些进展具有变革性意义。Patel等人通过分析来自5例原发GBM肿瘤的430个单个细胞，提供了scRNA-seq在GBM中最早的示范之一，揭示了广泛的瘤内转录异质性，涵盖致癌信号、增殖、免疫活性和缺氧等方面。Darmanis等人对肿瘤核心和周围浸润脑组织的细胞进行分析，表明在影像学定义的肿瘤边界之外的组织中可恢复大量转录上不同的肿瘤细胞。在此基础上，Neftel等人描述了一个整合模型，其中恶性GBM细胞占据四种主要转录状态——神经祖细胞样（NPC）、少突胶质祖细胞样（OPC）、星形胶质细胞样（AC）和间充质样（MES）——各状态间的可塑性由潜在遗传驱动因素和微环境塑造。
细胞分离与标记
通过机械剪碎、酶消化（常用木瓜蛋白酶或胶原酶体系）和搅拌等解离技术，从GBM组织活检或切除标本中分离单个细胞形成单细胞悬液。由于GBM组织细胞高度密集，但混杂坏死组织和浸润的非病变实质（尤其在肿瘤浸润边缘），最佳解离方案须与采样区域匹配以保护遗传物质、维持活力并防止细胞裂解。
单细胞分离方法包括：有限稀释法成本效益高且易于获取，但效率存在缺陷；荧光激活细胞分选（FACS）广泛用于GBM研究，包括通过5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）荧光状态分离肿瘤细胞，特异性高，但可能导致细胞应激、凋亡和RNA损伤，且需要较大初始样本量；激光捕获显微切割可直接从固定组织学切片获取单细胞。微流控技术也广泛用于单细胞分离和标记，DropSeq和10x Genomics Chromium等基于液滴的单细胞测序方法利用微流控系统，细胞与条形码凝胶珠混合并与油结合形成纳升级液滴，每个液滴理想情况下含一个细胞和一个珠子。珠子携带具有通用接头、独特细胞条形码、特定分子标识符（UMI）和poly-T尾的寡核苷酸以捕获mRNA。微孔板方法则将单细胞与携带类似寡核苷酸的磁珠配对。当新鲜GBM组织无法及时解离时，单核RNA测序（snRNA-seq）提供了替代方法，绕过酶解离，减少解离相关转录应激，并允许从冷冻组织中全面采样肿瘤微环境。
文库构建
捕获的RNA经逆转录形成第一链cDNA，随后通过聚合酶链反应（PCR）或体外转录（IVT）扩增。cDNA文库构建包括cDNA片段化、接头连接和合适长度cDNA片段的选择。这一基于RNA的cDNA文库流程不同于单细胞/单核DNA测序（scDNA-seq），后者通过全基因组扩增直接检测拷贝数变异（CNVs）、单核苷酸变异（SNVs）和插入缺失。scRNA-seq本身不扩增或测序基因组DNA，因此无法直接通过该途径确定DNA水平变异。在GBM研究中，全基因组扩增策略根据目标选择：较大区域用于推断CNV谱以区分肿瘤性与非肿瘤性细胞核，或较短序列用于检测与GBM驱动突变相关的SNVs和插入缺失，如EGFR、PDGFRA或TERT启动子改变。
测序
GBM研究中使用的多数单细胞测序平台采用第二代短读长技术，可同时读取大量小cDNA片段，但需要多步骤文库制备和扩增过程。相比之下，第三代长读长技术，如Pacific Biosciences（PacBio）单分子实时（SMRT）测序和Oxford Nanopore Technologies（ONT）纳米孔测序，在GBM基因组和转录组研究中应用日益增多。PacBio的高保真（HiFi）方法利用环化共有测序，典型读长15–20kb，单读准确率约99.9%。ONT读长可变且依赖文库：典型方案产生从不到千碱基到数十千碱基的读长，超长文库制备可超过100kb。对于RNA，PacBio的Iso-Seq流程需先将RNA逆转录为cDNA再测序全长转录本，而ONT独特地提供天然/直接RNA测序模式，无需逆转录或扩增即可直接测序RNA分子。长读长可分析短读长无法唯一比对的基因组重复区域中的碱基改变，并以碱基分辨率检测单分子核酸修饰。这一方法在GBM中日益受到关注，用于解析结构变异和染色体外DNA（ecDNA）扩增——这是该肿瘤类型中癌基因扩增的常见驱动因素。然而，与短读长技术相比，其单读准确率较低。目前，整合短读长和长读长的混合技术正在兴起。
生物信息学分析
生物信息学分析始于测序读段的质量控制，包括读段质量评估、去除接头和次优序列、比对到参考基因组以及过滤PCR重复。也可尝试直接从scRNA-seq读段进行变异检测，但仅限于表达的转录本，且受等位基因缺失、转录本覆盖不均和可模拟真实SNVs的RNA编辑事件干扰。大规模拷贝数谱可使用工具（如inferCNV、CopyKAT、HoneyBADGER）从scRNA-seq数据推断，这些工具检测相对于参考（通常为非恶性）细胞群体在连续基因组窗口中的平均表达变化。这些推断的CNV谱是相对剂量的计算估计，不应等同于在DNA水平直接测量的拷贝数改变。在GBM中，此步骤通常辅以推断CNV分析以区分恶性与非恶性细胞，这对区分浸润边缘肿瘤细胞与反应性或正常脑实质至关重要。单细胞测序最显著的优势之一在于探索细胞异质性。在GBM中，通过应用降维方法和聚类算法对具有相似转录谱的细胞分组，随后对照已建立的恶性细胞状态框架（如NPC样、OPC样、AC样和MES样状态）和分子亚型分析进行分类。
单细胞多组学
由于scRNA-seq单独不足以充分探索细胞内调控动态以及基因组和转录组异质性向蛋白质组功能的转化，单细胞技术已向结合转录组数据与表观基因组和蛋白质组层的多模态技术发展。分子条形码和细胞分离技术使高分辨率多组学分析成为可能，但组织解离干扰了细胞间相互作用和空间背景。为克服这些局限，新方法将先进成像技术，如基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI），与基于探针的转录本、蛋白质、脂质和代谢物标记相结合，实现具有增强灵敏度、分辨率和可扩展性的空间分辨多组学图谱。单细胞多组学识别与遗传、表观遗传和表型变异相关的调控过程并解析细胞异质性的能力是特别优势，有助于识别稀有细胞状态、区分功能性亚群和描述细胞间通讯网络。
GBM的瘤内和瘤间异质性
GBM的患者间异质性主要由遗传改变引起，包括TP53、PTEN、NF1和CDKN2A/B的缺失或失活改变，以及EGFR、PDGFRA和CDK4/6的扩增。Verhaak等人提出四种转录亚型：前神经型、神经型、经典型和间充质型。后续纳入单细胞分辨率的分析表明，神经亚型并不代表内在的恶性转录程序，而是源于非肿瘤性神经组织对批量肿瘤样本的污染。值得注意的是，scRNA-seq显示GBM肿瘤表现出瘤内可塑性，这些转录状态常在单个肿瘤内共存，并随时间及治疗响应而转变。
单核RNA测序（snRNA-seq）是另一种转录组技术，从分离的细胞核而非完整细胞分析基因表达。单细胞分析已鉴定四种复发性GBM细胞状态：神经祖细胞（NPC）样、星形胶质细胞（AC）样、少突胶质祖细胞（OPC）样和间充质样（MES）样。不同状态常在单个肿瘤内共存，其相对丰度与特定复发性拷贝数和突变改变相关，包括CDK4扩增（NPC样）、PDGFRA扩增（OPC样）、EGFR扩增（AC样）和NF1突变/缺失（MES样）。此外，Hazra等人利用scRNA-seq鉴定了与胶质瘤干细胞样群体相关的长链非编码RNA（lncRNAs）。富含于胶质瘤干细胞样群体的lncRNAs如GIHCG调控增殖、迁移和干性，支持lncRNA驱动的胶质瘤干细胞样群体可塑性和转录异质性有助于GBM适应性和治疗耐药的模型。然而，目前尚无临床批准的疗法特异性靶向胶质瘤干细胞样群体。
细胞状态转变与治疗耐药
肿瘤内在耐药：单细胞转录组研究揭示GBM耐药与肿瘤内在转录可塑性密切相关，而非固定的细胞身份。GBM细胞占据可互换的发育和反应性状态连续体，可作为治疗应激下适应性耐药的底物。后续scRNA和snRNA-seq研究证明标准治疗对这些转录状态施加强选择压力，最显著的是复发时前神经型（PN）向间充质型（MES）转变。原发和复发GBM样本的配对分析显示复发时MES细胞的比例和增殖活性显著增加，表明间充质转变是治疗耐药的特征。此外，鉴定出与早期静止MES细胞重新进入细胞周期相关的基因表达程序，抑制这些程序可降低GBM细胞活力。
TME驱动的耐药：与肿瘤内在可塑性并行，TME在强化耐药细胞状态中发挥关键作用。单细胞分析显示肿瘤细胞、神经胶质群体和免疫细胞之间的旁分泌和自分泌信号支持MES样肿瘤细胞的扩增和存活，尤其在复发时。MES样肿瘤细胞常在肿瘤边缘富集，促进侵袭、迁移和血管生成。在治疗或缺氧等外部应激下，干细胞样癌细胞可进一步分化为增殖性或MES样状态。耐药还通过免疫微环境的适应性重塑得以促进。GBM中主要的免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是单核细胞来源巨噬细胞，在复发期间增殖。De Leo等人证明这些TAMs内的代谢重编程，如PERK介导的糖酵解导致组蛋白乳酰化，增强其免疫抑制功能。
表型可塑性：GBM中治疗诱导的耐药日益被理解为动态TME相互作用的结果。更近期的单细胞分析通过证明复发肿瘤中单核细胞来源巨噬细胞扩增以及超突变GBM中CD8? T细胞浸润增加，挑战了早期批量来源的结论。TME群体并非被动旁观者，而是主动经历表型适应以强化治疗耐药。辐射诱导的巨噬细胞状态增强肿瘤存活。肿瘤细胞可塑性也促成对分子靶向治疗的耐药。受体酪氨酸激酶抑制（RTKI）常导致适应性信号重连和进入药物耐受持久状态。例如，达沙替尼诱导的PDGFRA抑制导致可逆性转变为静止的Notch和KDM6依赖状态。重要的是，这些持久状态可存在于未经治疗的肿瘤中，表明治疗失败可能并非由于统一的治疗诱导重编程，而是由于潜在耐药状态的差异生长。耐药似乎源于预先存在的异质性和治疗诱导适应的并行作用：预先存在的耐药细胞状态的选择和扩增，以及肿瘤和微环境细胞向药物耐受表型的适应性重编程。
未来展望：迈向转化性单细胞分析
GBM精准医学的目标是鉴定具有诊断、预后和治疗意义的分子特征。Wang等人通过收集肿瘤核心（TC）和瘤周脑组织（PTB）配对样本进行整合snRNA-seq和snATAC-seq分析，证明浸润性GBM细胞发生显著分子改变。肿瘤分子身份因位置而异，这种空间异质性显著促成治疗耐药。在转录组水平，从TC侵入PTB的肿瘤细胞在转录特征上更接近少突胶质祖细胞而非星形胶质细胞。双组学数据表明区域差异由不同转录调控因子驱动：激活蛋白-1（AP-1）活性从核心到周边递减，而BACH1递增。在小鼠模型中，同时靶向AP-1和BACH1比单一靶向治疗更有效减少肿瘤生长并延长生存。
精准医学的另一途径是将肿瘤内在分析与微环境和生态系统水平分析相结合。GBM内的髓系细胞和其他免疫细胞促成免疫抑制、T细胞功能障碍和治疗耐药。然而，scRNA-seq的缺点是扩增偏差和丢失事件产生的技术噪声。scRNA-seq已有助于理解GBM复发途径，例如复发GBM相比原发肿瘤表现出RAS/GEF GTP依赖性信号通路的突变。Lai等人整合scRNA-seq和批量RNA-seq数据集构建了预测GBM生存的预后模型，开发了基于43个与总生存相关的差异表达基因的"五基因风险评分预后模型"。脑脊液（CSF）的scRNA-seq作为液体活检在早期癌症诊断中显示出前景，但作为相对新兴领域，质量控制、数据处理和解释的标准化框架尚未完全建立。
最终，转化目标是将基于测序的快速分子分析引入GBM诊疗的实时手术和治疗决策中。概念验证已在术中出现，基于纳米孔的DNA甲基化分类器可在组织采样后约两小时内提供初步肿瘤分类，随后24小时内完成全面的SNV、CNV和结构变异分析，在前瞻性队列中与最终整合诊断达到高达90%的一致性。这些术中工作流程目前依赖快速DNA甲基化和突变分析而非scRNA-seq，后者较长的文库制备和分析时间仍是实时使用的障碍。实现更广泛的整合需要一个将多组学数据纳入常规工作流程的临床框架。
空间转录组学：绘制肿瘤微环境图谱
空间组学技术概述
鉴于GBM进展和治疗耐药由空间定义的细胞微环境驱动，保留空间背景的方法对精准医学应用至关重要。空间组学技术，包括空间转录组学、蛋白质组学和表观基因组学，涵盖在完整组织中同时测量大量分子的技术。GBM标本制备选择显著影响空间转录组数据质量。新鲜冷冻（FF）组织最好地保留RNA完整性（RIN≥7），是polyA捕获平台所必需，但要求术中冷冻和冷链处理。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织提供优越的形态学和存档稳定性，但福尔马林交联使RNA片段化，将FFPE兼容平台限制为靶向探针化学方法。配对比较显示，排除降解样本后FFPE来源的表达数据与FF相关性良好，保留支持亚型分类的能力，但置信度降低。大规模GBM结构空间表征，包括浸润边缘微环境，主要依赖FF材料。
空间转录组学
空间转录组技术通过测量完整细胞和组织内的mRNA转录本来定位和量化基因表达，保留其天然空间结构。这些技术可分为两大类：基于成像的和基于下一代测序（NGS）的方法。
第一类：基于成像的空间转录组学：这些方法依赖荧光标记探针原位杂交靶RNA分子，实现单细胞或亚细胞水平基因表达可视化。连续多轮探针杂交、成像和信号解码显著提高了转录本通量。基于原位测序（ISS）的方法通过在组织内直接进行测序反应确定转录本身份，还可检测序列变异包括SNVs。当前ISH技术包括：Xenium（10x Genomics）可分析FFPE和FF组织中数千个RNA靶标；多重容错荧光原位杂交（MERFISH）通过组合标记、连续成像和容错条形码实现0.1μm单细胞分辨率的多重基因表达分析；连续荧光原位杂交（SeqFISH+）结合连续和成像使用常规共聚焦显微镜，可在单个细胞中多重分析数千个基因；CosMx空间分子成像仪（SMI）通过多轮荧光分子条形码核酸杂交，在单张玻片上记录数千个RNA靶标的表达。当前ISS技术包括靶向ISS如空间分辨转录本扩增子读出图谱（STARMAP），以及非靶向ISS如条形码原位靶向测序（BaristaSeq）和荧光原位RNA测序（FISSEQ）。基于成像的空间转录组平台提供亚细胞空间分辨率和高度靶标特异性，但分割错误可导致相邻细胞间分子混合，混淆差异表达和相互作用分析。
第二类：基于测序的空间转录组学：基于测序的ST利用NGS提供基本无偏的全转录组分析同时保留空间信息，但通常牺牲空间分辨率。10x Genomics Visium是最广泛使用的基于测序的技术，利用玻片上印刷的空间条形码逆转录引物进行全转录组分析，兼容FF和FFPE样本，但无法达到单细胞分辨率。Slide-seq及其增强版Slide-seqV2使用密集排列的随机条形码珠子，分辨率高于Visium，接近细胞分辨率，但技术要求更高且不兼容历史FFPE材料。Stereo-seq利用DNA纳米球技术实现纳米级空间分辨率和极宽视野，但当前限于新鲜冷冻组织。NanoString GeoMx数字空间分析仪采用感兴趣区域（ROI）范式，结合空间分辨转录组分析和多重蛋白分析，兼容FFPE样本，但依赖ROI选择且缺乏真正单细胞分辨率。
GBM的空间结构
多项空间转录组和空间多组学研究显示GBM组织为不同但相互连接的空间微环境，其中肿瘤细胞状态、免疫组分和代谢程序遵循空间模式。早期转录组计划如Ivy胶质母细胞瘤图谱项目提供了区域基因表达的宝贵见解，但受组织分离和小样本量限制。
