SB16与地舒单抗参照药的分析相似性综合表征：基于先进正交分析方法的关键质量属性评价

《Drugs in R&D》：Analytical Characterization for Similarity Assessment Between Biosimilar SB16 and Denosumab Reference Product Using State-of-the-Art Analytical Method

　　

背景与目的：SB16已被开发并最近获批为地舒单抗参照药（denosumab reference product）的生物类似药，其通过靶向核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand, RANKL）抑制破骨细胞形成。本研究对SB16地舒单抗生物类似药进行综合分析表征，以证明其与参照药（Prolia和Xgeva）高度相似。方法：采用先进方法，通过并行比较和相似性范围方法评估分析相似性。评价的关键质量属性包括一级结构、翻译后修饰、高阶结构、纯度、糖基化、电荷异质性和生物学活性。相似性范围通过大量参照药批次检测建立（最多68批EU Prolia、35批US Prolia、29批EU Xgeva和17批US Xgeva）。结果：肽图确认100%序列覆盖率和相同氨基酸序列。高阶结构分析（圆二色谱、傅里叶变换红外、差示扫描量热法、氢/氘交换-质谱）显示相似的二级和三级结构。纯度评估（尺寸排阻-高效液相色谱、毛细管电泳-十二烷基硫酸钠）显示相似的单体含量和杂质谱。N-糖谱显示相似的高甘露糖种类；半乳糖基化差异被认为无临床意义。电荷异质性（成像毛细管等电聚焦、阳离子交换）显示相似的电荷变异体谱。Fab相关活性（RANKL结合、RANKL中和和抗分化）与Fc相关活性（新生儿片段可结晶受体结合、Fcγ受体结合、补体成分1q结合、抗体依赖细胞介导的细胞毒性和补体依赖的细胞毒性）显示相似结果。结论：SB16在所有结构、理化及生物学特性上与地舒单抗参照药高度相似，为生物相似性提供稳健分析证据。该数据集为生物类似药开发提供有价值的参考信息。

研究背景：SB16是靶向RANKL（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，核因子κB受体活化因子配体）的地舒单抗生物类似药（biosimilar，指与参照药高度相似且无临床意义差异的生物制品），近期获FDA和European Commission批准。地舒单抗参照药（reference product, RP）包括Prolia和Xgeva，二者由同一活性药物物质制造，结构和理化性质及作用机制相同，仅在蛋白浓度、容器封闭系统等制剂方面存在差异。生物制品由活细胞复杂工艺生产，难以避免与RP的微小结构或功能差异，因此监管机构要求通过强化表征研究排除影响临床疗效和安全性的变异；FDA和EMA指南推荐先进行广泛结构和功能表征的分析相似性评价，再进行临床研究。既有SB16与RP的I/III期临床相似性结果，本研究进一步提供覆盖EU/US来源、两种规格RP及大量RP批次的全面的分析表征证据。研究人员开展了SB16与Prolia/Xgeva的分析相似性研究，结论为SB16在全部结构、理化和生物学属性上与RP高度相似，为生物相似性提供稳健分析证据，并为地舒单抗生物类似药开发提供参考数据。

关键方法概述（≤250字）：研究采用基于风险分层的质量范围（mean ± xSD）与并行比较评价相似性；以LC-ESI-MS肽图（trypsin、Lys-C、Asp-N）分析一级结构；以CD、FT-IR、DSC和HDX-MS分析高阶结构；以SEC-HPLC和CE-SDS分析纯度与杂质；以HILIC-UPLC N-糖谱、icIEF和CEX分析糖基化与电荷异质性；以ELISA、SPR及细胞报告基因/细胞毒试验评价RANKL结合与中和、抗分化、FcRn、Fcγ受体、C1q、ADCC和CDC。参照药为EU/US来源Prolia和Xgeva商业批次，最多68批EU Prolia、35批US Prolia、29批EU Xgeva、17批US Xgeva。

研究结果：
3.1 一级结构（Primary Structure）：通过三种内肽酶肽图及串联质谱，SB16与RP均达100%序列覆盖且氨基酸序列一致；N端焦谷氨酸和C端赖氨酸变异体定性定量一致；氧化、脱酰胺等肽图相似。
3.2 高阶结构（Higher Order Structures）：远紫外和近紫外CD显示相似光谱及三级结构；FT-IR二阶导数显示酰胺I/II区相似；DSC显示热稳定性相似；HDX-MS显示氘摄取动力学对称。
3.3 纯度与杂质（Purity and Impurity）：SEC-HPLC显示HMW和单体比例相似；非还原/还原CE-SDS显示电泳谱相似，IgG、LC+HC、2H1L水平相似。
3.4 N-糖谱（N-Glycan Profile）：HILIC-UPLC显示高甘露糖总量相似，SB16检出M9而RP未检出；SB16半乳糖基化较低，但基于作用机制（不涉及Fc效应功能）及已发表证据认为无临床意义。
3.5 电荷异质性（Charge Heterogeneity）：icIEF和CEX显示所有SB16批次落在预设EU/US相似范围内；SB16酸性/碱性均值有差异，碱性区有SB16特异峰（约pI 8.98，CEX约25–26 min），归因于C端赖氨酸等特征明确的肽图差异，生物学活性试验显示各CEX组分与起始材料相似。
3.6 生物学活性（Biological Activity）：Fab相关（RANKL结合、RANKL中和、抗分化）和Fc相关（FcRn、FcγRIIa/IIb/IIIa、C1q、ADCC、CDC）评价显示SB16批次在相似范围内或并行比较相似；FcγRIa结合、ADCC和CDC在SB16与RP中均未观察到。
3.6.1 Fab相关生物学活性（Fab-Related Biological Activity）：RANKL结合、中和及抗分化均无有意义差异，SB16批次在EU/US相似范围内。
3.6.2 Fc相关生物学活性（Fc-Related Biological Activity）：FcRn、FcγRIIa/IIb/IIIa、C1q结合无有意义差异；FcγRIa结合、ADCC、CDC未观察到。

讨论部分总结：研究依据FDA和EMA指南及质量属性风险评估进行分层，采用质量范围或并行比较。一级结构一致，高阶结构相似，纯度相似；IgG₂二硫键异构体差异因体内可转换而不认为临床意义；半乳糖基化差异基于无Fc效应功能、无ADCC/CDC及文献证据判为无临床意义；电荷异质性由脱酰胺、C端赖氨酸、C端α-酰胺化等解释且不影响活性；生物活性相似。研究结论（Conclusions）译文：本研究表征了SB16与地舒单抗RP在结构、理化和生物学特性上的相似性。综合分析表明SB16与地舒单抗RP高度相似。这些分析数据构成支持SB16与地舒单抗RP生物相似性的总体证据。