《Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion》：Study of the Association Between Factor V Methylation and Pulmonary Thromboembolism
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作为一种严重威胁生命的疾病，肺血栓栓塞症（PTE）具有较高的发病率和死亡率。识别有效的生物标志物可改善PTE预后。在本研究中，研究人员招募了16对PTE患者及其血缘相关亲属作为对照，以探讨DNA甲基化与PTE之间的关联。研究人员采用MassArray PCR分
作为一种严重威胁生命的疾病，肺血栓栓塞症（PTE）具有较高的发病率和死亡率。识别有效的生物标志物可改善PTE预后。在本研究中，研究人员招募了16对PTE患者及其血缘相关亲属作为对照，以探讨DNA甲基化与PTE之间的关联。研究人员采用MassArray PCR分析了F5（凝血因子V）和PROS1（蛋白S，PS的编码基因）的DNA甲基化模式，并对F5和PROS1的热点突变进行了图谱分析。研究人员发现，PTE患者往往较其血缘相关亲属年龄更大。表观遗传学（epigenetics）参与PTE，PTE患者被发现存在F5_CpG_10低甲基化和PROS1_CpG_29–33高甲基化。检测F5_CpG_10和PROS1_CpG_29–33甲基化可能在PTE早期发现和疾病进展监测中具有潜在价值。恢复正常DNA甲基化模式可能为PTE的靶向干预提供有前景的途径，值得深入研究。
静脉血栓栓塞症（VTE，指深静脉血栓形成与肺血栓栓塞症的总称）是继心肌梗死和卒中之后第三常见危及生命的心血管疾病，每年约每1000人中有3人受累，终生风险可达10%。肺血栓栓塞症（PTE，血栓阻塞肺动脉或其分支所致的疾病）是VTE的主要分支，90天死亡率可高达30%，住院患者近10%死亡，误诊率接近70%；未治疗PTE死亡率可达30%，治疗后降至5%，因此有效筛查十分重要。遗传因素在VTE发生和预后中起关键作用：F5 Leiden是最常见遗传风险因素，但仅约10%的F5 Leiden个体一生发生血栓，至少50%血栓事件由附加易感因素诱发；白种人突变率较高而黑人VTE总体发病率更高；F5 Leiden患者VTE复发率与一般人群相似。基因型与表型不一致提示表观遗传学参与。DNA甲基化（DNA methylation，在不改变DNA序列情况下对胞嘧啶进行甲基化修饰的表观遗传机制）相对稳定，可通过CpG岛（CpG islands，富含CpG二核苷酸的区域）启动子甲基化抑制基因表达，并已与多种肺部疾病及肺癌液体活检相关，但F5甲基化与PTE的关系尚不明确。为此，研究人员以16对PTE患者及健康血缘相关亲属为对照，分析F5和PROS1甲基化及热点突变。研究结论为PTE患者存在F5_CpG_10低甲基化和PROS1_CpG_29–33高甲基化，二者可能作为PTE早期检测和疾病进展监测的潜在生物标志物，并可能整合入血栓风险预测模型；恢复正常DNA甲基化模式可能为PTE靶向干预提供新途径。
关键技术方法：研究队列来自云南省第三人民医院呼吸科住院确诊的PTE患者16例，以其健康、无既往及当前血栓征象、年龄>18岁的血缘相关亲属16例为对照；采集外周静脉血3 mL提取基因组DNA。采用MassArray PCR（MassArray聚合酶链反应）进行靶向DNA甲基化分析：亚硫酸氢盐处理、目标序列PCR扩增、虾碱性磷酸酶去除游离dNTP、转录酶切割、树脂纯化，产物转入384孔SpectroCHIP?生物阵列，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测，EpiTYPER?软件分析，以G峰和A峰面积比定量甲基化水平。同时分析F5和PROS1热点突变。统计采用Student t检验、Welch校正和Mann Whitney U检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
研究结果：
临床特征：研究纳入16对PTE患者与血缘相关亲属。PTE患者平均年龄70.13 ± 10.83岁，对照44.88 ± 7.50岁，PTE组年龄更大（P < 0.0001）；两组体重指数（BMI，体质量/身高平方）相似（PTE组24.44 ± 4.25，对照组23.90 ± 1.87，P = 0.6466）。随机分为探索组（P1–P8/N1–N8）和验证组（P9–P16/N9–N16）；探索组PTE患者年龄68.00 ± 11.56岁、对照45.00 ± 6.74岁（P = 0.0017），BMI分别为24.02 ± 2.76和24.26 ± 1.29（P = 0.8243）；验证组PTE患者年龄72.25 ± 10.35岁、对照44.75 ± 8.66岁（P < 0.0001），BMI分别为24.86 ± 5.53和23.53 ± 2.35（P = 0.5481）。PTE组肺动脉或其分支被血栓阻塞，血凝块多为多灶性，见于双肺和下叶；深静脉血栓形成（DVT，深静脉内血栓形成）见于13例PTE患者（81.25%），最常见于小腿肌静脉和腘静脉，对照组无DVT。最常见合并症为高血压（6例，37.50%），其次为肺心病（5例，31.25%），慢性阻塞性肺心病居第三（4例，25.00%）；手术史、制动和感染为潜在诱因。
F5甲基化分析：研究人员提取外周血DNA，经质控和亚硫酸氢盐处理后扩增目标序列并测序定量；分析PTE患者与对照亲属F5甲基化谱，CpG_6、CpG_10和CpG_12甲基化水平分布符合正态分布。探索阶段PTE患者F5_CpG_10甲基化显著降低；验证阶段F5_CpG_10甲基化亦显著降低；整合全部纳入个体结果一致。因此，F5_CpG_10低甲基化与PTE相关。
PROS1甲基化分析：鉴于F5功能与PS密切相关，研究人员在探索阶段检测PROS1甲基化，发现PTE患者PROS1_CpG_29–33显著高甲基化。
热点突变分析：研究人员评估F5和PROS1热点突变，探索阶段PTE患者及其血缘相关亲属均未检出突变。
综上，PTE患者存在显著F5_CpG_10低甲基化和PROS1_CpG_29–33高甲基化。
讨论部分总结：VTE是多因素医学问题，遗传、获得性和环境因素共同参与；PTE因高死亡率尤为突出。本研究发现表观遗传学参与PTE，F5_CpG_10低甲基化和PROS1_CpG_29–33高甲基化可作潜在生物标志物。F5 Leiden通过活化蛋白C（APC，抗凝相关蛋白）抵抗表型增加血栓倾向，并干扰APC介导的凝血因子Ⅷ灭活、促进凝血酶生成，使VTE风险增加3–4倍；其突变率存在人群差异，但不同人群形成VTE的可能性相似，家族性杂合子风险高于一般筛查杂合子，DNA甲基化可至少部分解释其发病机制。蛋白S（PS，依赖维生素K的抗凝蛋白）与APC协同抑制F5，PS缺乏增加PTE易感性和VTE风险；F5 Leiden在PS缺乏者中更常见并产生 multiplicative effects，PROS1在易栓症家族中高突变，PS缺乏主要归因于功能丢失包括基因失活；本研究发现PTE患者PROS1_CpG_29–33高甲基化。年龄与VTE风险和发病率增加相关，超过70%的PTE患者年龄>50岁；肺老化伴随DNA甲基化演变，DNA甲基化可动态响应终生环境暴露并与年龄和肺病相关。肥胖亦是VTE风险因素，F5 Leiden合并肥胖或超重时绝对血栓风险增加；饮食营养与DNA甲基化和体重相关，因此可在高龄和肥胖的PTE高危个体中安排F5_CpG_10低甲基化和PROS1_CpG_29–33高甲基化筛查。DNA甲基化在CpG岛由DNA甲基转移酶添加甲基，参与基因组印记、X染色体失活和基因转录调控，高甲基化一般与转录抑制相关；异常DNA甲基化与哮喘、HIV相关慢性阻塞性肺疾病及慢性血栓栓塞性肺动脉高压等相关。本研究发现F5_CpG_10低甲基化和PROS1_CpG_29–33高甲基化与PTE显著相关，可作VTE潜在诊断和预后生物标志物，并可通过血液检测微创评估。CTPA提高了小亚段PTE检出，但在慢性肾功能不全和孕妇中受限；PTE相关DNA甲基化可能为原因或既往PTE后果，检测F5_CpG_10和PROS1_CpG_29–33甲基化可加入易栓症液体活检筛查，即使无可识别风险因素的VTE或疑似易栓症患者，检测也有助于在PTE发生前启动适当治疗。局限包括：靶向PCR测序遗漏其他基因信息，全局DNA甲基化与VTE相关，F7甲基化升高与冠心病风险降低相关，其他表观机制如组蛋白甲基化和RNA沉默也可能参与PTE；F5_CpG_10和PROS1_CpG_29–33甲基化的临床意义需大样本前瞻性多中心研究，其与PTE患者结局的相关性亦需进一步探索。
研究结论翻译：总之，PTE患者存在F5_CpG_10低甲基化和PROS1_CpG_29–33高甲基化。检测F5_CpG_10和PROS1_CpG_29–33甲基化可能在PTE早期发现和疾病进展监测中具有潜力，也可整合入现有血栓风险预测模型。使用DNA甲基转移酶抑制剂或去甲基化药物恢复正常DNA甲基化模式可能为PTE靶向干预提供有前景的途径，值得深入研究。
