低温下转基因光敏色素D与光敏色素B协同促进光形态建成

《Plant Cell Reports》：Transgenic phytochrome D cooperates with phytochrome B to promote photomorphogenesis at low temperatures

　　

关键信息：光敏色素B（phytochrome B, phyB）光受体的功能由其同源对应物——光敏色素D（phytochrome D, phyD）在低温下增强，从而增加了植物响应波动环境条件的表型可塑性。 摘要：光是动态变化的环境因子，影响植物生长和发育的几乎每一个方面。光受体检测光信号，其中光敏色素（phytochromes, PHY）专门监测红光和远红光。拟南芥（Arabidopsis thaliana）有五种光敏色素，分别命名为phyA至phyE。phyA和phyB是被广泛研究的光敏色素反应的关键介导者；而其他光敏色素的精确功能仍知之甚少。为了探究phyD的信号传导机制，研究人员在缺乏其他内源光敏色素的遗传背景下单独过表达了phyD-YFP，或将其与phyB-CFP共同过表达。在低温和高温下比较了光形态建成反应、蛋白质积累和转录组变化。研究人员发现，phyD-YFP单独不能促进光形态建成，但它以一种温度依赖的方式显著增强了phyB-CFP和内源phyB的红光信号传导，在低温下有效而在高温下无效。同时，在低温下，共表达phyD-YFP和phyB-CFP所触发的光诱导转录组变化比单独表达任一转基因都更为显著。由于phyD-YFP比phyB更耐光，并且PHYB-CFP和内源PHYB在与PHYD-YFP共存于光照下时都积累到更高水平，因此phyD很可能通过稳定PHYB蛋白来刺激phyB信号传导。为了解释PHYD-YFP如何在两种温度下都能提高PHYB水平却仅在低温下刺激信号传导，研究人员提出，phyD和phyB在两种温度下均形成耐光的异源二聚体，但这些异源二聚体仅在低温下才具有功能。这些发现表明，phyB和phyD通过功能协作介导温度依赖的光信号反应，为植物在不断变化的环境条件下提供了发育灵活性。

研究背景与科学问题

光是影响植物生长发育最核心的动态环境因子之一。植物作为固着生物，必须通过光合作用获取能量，其生长策略需围绕光环境进行优化。在无光条件下，幼苗发生暗形态建成（skotomorphogenesis），表现为下胚轴伸长、子叶闭合；而在光照下则启动光形态建成（photomorphogenesis），表现为下胚轴缩短、子叶展开并变绿。植物拥有一套精密的光受体系统来感知不同波长的光信号，其中光敏色素（phytochromes, PHY）主要负责感知红光（R, λ_max~660 nm）和远红光（FR, λ_max~730 nm）。

拟南芥基因组编码五种光敏色素（phyA至phyE）。这些蛋白以两个约125 kDa的单体形成二聚体发挥功能，每个单体结合一个线性四吡咯生色团以实现光敏感性。光敏色素以非活性形式（Pr）合成，吸收红光后转化为生物活性的Pfr形式，而远红光可使其快速逆转回Pr态。热不稳定的Pfr还能通过不依赖光的过程（即热逆转, thermal reversion）回到Pr态，从而减弱光信号传导。高温加速了这一热逆转过程，使得光敏色素可作为温度传感器调控植物发育。

尽管phyA和phyB已被广泛研究并被确认为大多数光敏色素反应的关键介导者，但phyC、phyD和phyE等含量较低的光敏色素的精确功能仍不清楚。特别是，phyD是phyB最接近的同源物，源自十字花科分化后的基因复制事件。尽管两者序列高度同源，但phyB是主要的红光响应光受体，积累量高，而phyD水平很低，仅参与萌发、去黄化和开花等过程的次要调控。有趣的是，在光照下，phyD比phyB稳定得多。已有研究表明，过表达phyD-YFP的转基因拟南芥系本身仅介导非常有限的光反应，但在低温下能与phyC高效协作，调控幼苗发育和成花诱导相关的特征性基因集。这一发现促使研究人员探究phyD是否能与其他光敏色素（如phyB）也发生类似的温度依赖性协同作用。

研究内容与主要结论

本研究旨在揭示phyD与phyB之间的功能互作关系及其温度依赖性。研究人员通过将携带荧光标签的phyD-YFP和phyB-CFP在缺失所有内源光敏色素的五突变体（abcde）背景下单独或共同过表达，系统分析了它们在低温和高温下的光形态建成反应、蛋白质积累模式和全转录组变化。主要结论如下：

phyD单独不能促进光形态建成，但与phyB协同作用且在低温下效果显著。 在持续红光照射下，phyD-YFP单独无法抑制下胚轴伸长；phyB-CFP可在两种温度下介导一定程度的光形态建成，但其效率低于仅含内源phyB的aBcde植株。当phyD-YFP与phyB-CFP共表达时，在17°C低温下观察到显著的下胚轴伸长抑制协同效应，其程度与aBcde植株相当，甚至接近野生型水平；而在27°C高温下则无此增强效应。类似地，将phyD-YFP导入aBcde背景（即PHYD-YFP/aBcde）同样仅在低温下增强了光形态建成反应。

phyD-YFP通过稳定phyB蛋白水平增强信号传导。 蛋白免疫印迹分析显示，在持续红光下，phyD-YFP比phyB-CFP更稳定，且当两者共表达时，phyB-CFP的积累量显著高于其单独表达时的水平。这种增强效应依赖于光照条件，在黑暗条件下并不明显。重要的是，phyD-YFP同样能够稳定内源phyB蛋白。然而，尽管phyD-YFP在低温和高温下均能提升phyB-CFP的蛋白水平，但其对光形态建成的促进作用仅出现在低温下，提示蛋白丰度增加并非唯一决定因素。

转录组分析证实低温下phyD-YFP与phyB-CFP协同重编程基因表达。 RNA-seq分析表明，在24小时红光处理后，aBcde和PHYB-CFP植株的转录组变化趋势相似，但aBcde中差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）数量更多，与其更强的光形态建成表型一致。在17°C低温下，PHYD-YFP+PHYB-CFP双转基因植株的DEG数量（2807个）远多于PHYB-CFP单转基因植株（1529个），且其转录组变化模式与aBcde植株高度相似；而在27°C高温下，两者的DEG数量相近，转录组相似性也更接近PHYB-CFP而非aBcde。基因本体论（Gene Ontology, GO）分析进一步证实，在低温下，光响应相关GO类别中的DEG数目在双转基因植株中显著增加。

脉冲红光实验验证了phyD-YFP对phyB的稳定化作用。 在每3小时给予1分钟饱和红光脉冲的处理下，phyD-YFP同样能显著增强phyB-CFP和内源phyB介导的光形态建成，并伴随phyB蛋白水平的升高，表明这种协同作用不依赖于连续光照条件。

关键技术方法

1. 1.
   转基因材料构建：在拟南芥Ler生态型的五突变体（phyA-201 phyB-1 phyC-1 phyD-1 phyE-1, 简称abcde）背景下，利用强组成型35S启动子过表达PHYD-YFP，以及利用PHYB自身启动子表达PHYB-CFP，并通过遗传杂交获得双转基因株系。同时将35S:PHYD-YFP导入仅保留内源phyB的四突变体（phyA-201 phyC-1 phyD-1 phyE-1, 简称aBcde）背景。
2. 2.
   光形态建成表型分析：在不同温度（17°C、22°C、27°C）和不同强度（弱至强）的持续红光或脉冲红光（1 min/3 h）条件下，测量4日龄幼苗的下胚轴长度，以相对于暗对照的抑制率评估光信号传导效率。
3. 3.
   蛋白质免疫印迹与免疫共沉淀：使用抗GFP抗体（同时识别PHYD-YFP和PHYB-CFP）、抗HA抗体（特异性识别PHYB-CFP上的HA标签）和抗PHYB抗体（识别内源phyB）进行免疫印迹，检测蛋白积累水平。使用μMACS Anti-GFP分离试剂盒进行免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）验证蛋白间相互作用。
4. 4.
   转录组测序（RNA-seq）与分析：对在17°C或27°C下暗培养4天后经1小时或24小时强红光（50 μmol m^-2 s^-1）处理的幼苗进行总RNA提取和测序。使用STAR比对至TAIR10参考基因组，edgeR进行差异表达分析，筛选标准为FDR校正p值（q值）< 0.05且倍数变化≥ 2。

研究结果详述

1. phyD-YFP与phyB-CFP及内源phyB在低温下协同促进光形态建成

通过下胚轴伸长抑制实验，研究人员发现：

• •
  phyD-YFP单独在任何温度和光强下均无法抑制下胚轴伸长。
• •
  phyB-CFP在两种温度下均可介导一定程度的抑制，但效率低于仅含内源phyB的aBcde植株。
• •
  在17°C低温下，PHYD-YFP+PHYB-CFP双转基因植株的下胚轴抑制效果显著优于PHYB-CFP单转基因植株，达到与aBcde植株相当的水平；而在27°C高温下，两者无显著差异。
• •
  PHYD-YFP/aBcde植株相比aBcde植株同样仅在低温下表现出增强的光形态建成。

2. phyD-YFP提高PHYB-CFP及内源PHYB蛋白水平

免疫印迹分析结果显示：

• •
  在持续红光下，phyD-YFP比phyB-CFP更稳定，且phyD-YFP的积累不受phyB-CFP共表达的显著影响。
• •
  在PHYD-YFP+PHYB-CFP双转基因植株中，PHYB-CFP在红光下的积累量显著高于其在PHYB-CFP单转基因植株中的水平；这种增强效应是光照依赖的，在黑暗中不明显。
• •
  在PHYD-YFP/aBcde植株中，内源phyB蛋白水平同样因phyD-YFP的共表达而升高。
• •
  值得注意的是，phyD-YFP在低温和高温下均能提升PHYB-CFP的蛋白水平，但仅在低温下促进光形态建成。

3. phyD-YFP与phyB-CFP在低温下协同实现转录组重编程

基于RNA-seq的比较分析发现：

• •
  aBcde与PHYB-CFP植株在两种温度下的红光诱导转录组变化高度相关，但aBcde中鉴定出的DEG数量更多，与其更强的表型一致。
• •
  在17°C低温下，PHYD-YFP+PHYB-CFP植株的DEG数量（2807个）远多于PHYB-CFP植株（1529个），其转录组变化模式与aBcde植株更为相似；而在27°C高温下，两者的DEG数量相当（2073 vs. 2191）。
• •
  GO分析显示，在低温下，光响应相关类别（如“对红/远红光的响应”、“光合作用”）中的DEG数目在双转基因植株中显著增加，与表型增强一致。

4. phyD-YFP在脉冲红光下支持phyB功能

在脉冲红光（1 min/3 h）处理下：

• •
  phyD-YFP单独仍不能介导光形态建成。
• •
  PHYB-CFP和aBcde植株表现出中等程度的响应。
• •
  共表达phyD-YFP显著增强了PHYB-CFP和aBcde植株的响应，其中PHYD-YFP/aBcde植株的响应恢复至野生型水平。
• •
  蛋白分析表明，脉冲红光同样导致PHYB-CFP和内源PHYB水平大幅下降，而phyD-YFP的共表达有效缓解了这一下降。

讨论与结论总结

本研究的核心发现是，phyD通过与phyB形成功能复合物，在低温下增强植物的光响应能力。尽管phyD-YFP本身不具备独立的光形态建成活性，但它能够显著提升phyB的蛋白稳定性，从而扩大可用于信号传导的活性光敏色素库。这种稳定化作用可能源于两者形成更耐光的异源二聚体（heterodimers），因为Co-IP实验证实两者在不同温度下均可形成蛋白复合物。

然而，一个关键悖论是：phyD-YFP在低温和高温下均能提升phyB蛋白水平，却仅在低温下增强信号传导。研究人员提出的合理解释是：在高温下，phyD-YFP可能因构象异常而功能受限，或者由phyD-YFP与phyB形成的异源二聚体热逆转速率极快，导致即使蛋白总量增加，活性Pfr形式的稳态水平仍然很低，无法转化为有效的信号输出。这揭示了蛋白丰度与Pfr稳定性之间的关键权衡。

综合而言，本研究不仅阐明了phyD与phyB在低温下的协同工作机制，还与此前发现的phyD与phyC的协同作用一起，描绘了一个多层次的光敏色素协作网络。这些发现有力地证明了看似冗余的光受体成员如何通过精细的温度依赖性互作，赋予植物在不同热环境中所需的发育可塑性（developmental plasticity）。

研究结论：研究人员得出结论，phyD-YFP通过在低温下物理稳定phyB蛋白来增强植物的光响应能力。这种功能协作使得phyB信号水平得以提升，尤其是在低温条件下成为增强信号传导的基础。此外，研究人员此前发现phyD在低温下也与phyC存在协同互作。综上所述，这些结果揭示了phyD与其他光敏色素的协同作用可以在特定条件下增强光形态建成，为看似冗余的光受体如何通过协作确保植物在多样化的热环境中保持发育可塑性提供了一个清晰的范例。