巴西铁质露营地草原（campo rupestre ferruginoso）凤梨科植物积水叶腋原核生物群落的共享核心与宿主特异性分异

《Symbiosis》：Prokaryotic assemblages in bromeliad phytotelmata reflect shared and host-specific patterns in campos rupestres

　　

凤梨科植物在巴西许多生态系统中发挥关键生态作用，尤其是 campo rupestres（巴西露营地草原），但正日益受到巴西米纳斯吉拉斯州 Iron Quadrangle 地区采矿和采掘活动的威胁。其充满水的叶腋，即植物积水叶腋（phytotelmata），宿主多样微生物群落，这些群落可能影响宿主适合度，然而塑造这些群落的生态驱动因素仍知之甚少，尤其是在濒危的铁质露营地草原（campo rupestre ferruginoso）中。本研究采用 16S rRNA 基因测序和功能预测（PICRUSt，Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States，未观测状态重建的群落系统发育研究）比较两种共存且形态不同的物种 Aechmea nudicaulis 和 Vriesea minarum 的植物积水叶腋中原核生物群落，样本来自巴西米纳斯吉拉斯州 Serra da Piedade 一个受保护的铁质露营地草原地点。研究人员假设宿主物种间植物形态和微环境条件的差异会导致微生物群落结构和功能潜力的差异。尽管两个物种共享一个微生物核心，但观察到 α多样性（alpha diversity）、群落组成和预测功能谱存在显著差异。最丰富的细菌门为 Proteobacteria、Verrucomicrobia 和 Planctomycetes，而 Archaea 中 Euryarchaeota 占主导。pH、电导率和无机碳等环境变量与群落组成相关。值得注意的是，与氮和碳循环途径相关的预测 KO（KEGG Orthology，KEGG直系同源）在两个宿主物种间显示差异丰度。这些发现表明凤梨科植物积水叶腋作为宿主和环境过滤的微生境，支持独特且多样的微生物群落。鉴于其在养分循环中的作用，这种相互作用可能影响植物适合度和生态系统功能。理解这些关系对于指导脆弱山地系统的保护工作很重要。

本研究聚焦巴西铁质露营地草原（campo rupestre ferruginoso）中凤梨科植物积水叶腋（phytotelmata）原核生物群落的宿主相关格局。凤梨科（Bromeliaceae）是巴西植物区系的重要组成，记录有1,379种原生种（约38%），在 campo rupestres（巴西露营地草原）中多样性突出；Iron Quadrangle 地区因铁质基质（当地称 canga）与采矿、采掘活动而持续受威胁，其凤梨科植物中81%为濒危物种，Vriesea minarum 本身在巴西官方受威胁植物红色名录中列为濒危（EN）。凤梨科植物由叶片形成蓄水叶腋，为多样生物提供微环境，并可能与微生物形成养分获取、分解与竞争等复杂互作。已有研究关注雨林和海拔梯度下凤梨科相关微生物群落的组成与环境驱动，但在生理上独特、高海拔、养分贫瘠的岩石草地生态系统中，宿主身份和环境变量如何塑造这些群落仍未被探索。基于此，研究人员提出两项假设：其一，两种凤梨科植物因物种特异性形态和生理性状，其植物积水叶腋微生物群落在组成和结构上不同；其二，pH、电导率和无机碳浓度等环境变量与群落组成及预测功能潜力相关。研究人员据此开展比较研究，得出两物种共享微生物核心但 α多样性、群落组成和预测功能谱存在显著差异的结论，并认为植物积水叶腋是受宿主和环境过滤的微生境，其微生物组可能通过养分循环影响宿主适合度和生态系统功能；这对脆弱山地系统的保护策略具有意义。

关键技术方法：研究地点为巴西米纳斯吉拉斯州 Serra da Piedade 的 Serra da Piedade 州立自然纪念地（MONAESP）铁质露营地草原；采集 Aechmea nudicaulis (L.) Griseb.（AN）18份和 Vriesea minarum L.B.Sm.（VM）19份，共37份植物积水叶腋水样（中央罐和/或外部叶腋）。测定 pH、电导率、总氮（TN）、总有机碳（TOC）、无机碳（IC）及离子色谱。提取 DNA 后扩增 16S rRNA 基因 V3–V4 区，Illumina MiSeq 测序；以 QIIME v1.9.1、USEARCH v8、Greengenes/RDP 分类；计算 α/β多样性；用 PICRUSt 预测功能；以 Wilcoxon 秩和检验、主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）、Spearman 秩相关、DESeq2 和 t 检验比较。

研究结果：3.1 理化特征：通过 Wilcoxon 秩和检验和 PCA 比较 AN 与 VM 植物积水叶腋水化学，发现电导率、IC 和 pH 在 VM 中显著高于 AN，样本在 PCA 空间中倾向分组；电导率、IC、pH（以及 TN 和 TOC）高度显著相关（rho>0.67，校正 p<0.05），提示罐内酸度可能是两物种差异特征；铵根（NH₄⁺）<1.25 mg/L、氯离子（Cl^?）<1.0 mg/L、磷酸根（PO₄^3?）<1.25 mg/L、钾离子（K⁺）<2.5 mg/L、钠离子（Na⁺）<1.0 mg/L 低于检测限而被排除。结论是每个凤梨科物种的植物积水叶腋具有特征性微环境，可能与理化条件相关。3.2 测序与多样性分析：通过 16S rRNA 测序获得1,585,099条高质量序列，AN 平均27,597条、VM 平均57,282条，聚类为7,976个操作分类单元（OTU, Operational Taxonomic Unit）；所有 α多样性指标（Observed OTUs、Shannon、Inverted Simpson）在 VM 中显著更高；基于 Bray–Curtis 距离的非度量多维尺度（NMDS, Non-Metric Multidimensional Scale）显示两物种微生物群落明显分离。结论是 VM 宿主更多样微生物群落，两物种群落分明，可能受宿主性状和环境条件共同影响。3.3 原核群落组成：通过分类组成和 DESeq2 差异丰度分析，在 AN 与 VM 细菌群落中发现34门、90纲、161目、264科和436属；古菌相对频率低，Euryarchaeota 平均0.05%、Crenarchaeota 0.001%，其余为 Bacteria；最丰富细菌门为 Proteobacteria（35.9%）、Verrucomicrobia（20.7%）、Planctomycetes（13.8%）和 Firmicutes（9.3%）。AN 中 Archaea 平均0.09%（Crenarchaeota 0.003%、Euryarchaeota 0.087%）；VM 仅检出 Euryarchaeota，平均0.023%；Candidatus Methanoregula 在 AN 最丰富（0.053%），YC-E6 未鉴定属在 VM 为0.010%，仅这两个古菌属在 VM 中显著低于 AN。细菌中28门共享，4门为 AN 特有：TPD-58、FBP、Lentisphaerae 和 WS3；AN 以8门占95.5% OTU 相对频率，Proteobacteria、Verrucomicrobia 和 Planctomycetes 均>19%，Acidobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes 和 Armatimonadetes 为1–8%；VM 中 Proteobacteria 与 Verrucomicrobia 合计58%，Firmicutes 11.9%、Actinobacteria 4.3%。70纲共享，14纲为 AN 特有、2纲为 VM 特有；Alphaproteobacteria 在 VM 为27.6%、AN 为18.0%；Pedosphaerae 在 AN 与 VM 分别为17.1%和5.9%，Clostridia 为6.4%和11.5%，Planctomycetia 为10.7%和5.5%，Betaproteobacteria 为6.6%和9.1%。430属中207属可鉴定、346属共享；最丰富可鉴定属为 Clostridium（平均1.9%）、Magnetospirillum（1.6%）、Candidatus Koribacter（1.5%）、Sporomusa（1.2%）、Azospirillum（1.0%）和 Sediminibacterium（1.0%）；AN 有43个特有属（平均0.77%），VM 有41个特有属（0.23%）；Limnohabitans、Sediminibacterium 和 Candidatus Solibacter 等在 AN 更频繁，Acinetobacter、Azospirillum、Bosea 和 Burkholderia 等在 VM 更高。结论是各宿主特有属相对频率低（<1%），细菌群落主体共享但比例不同。3.4 功能预测：通过 PICRUSt 预测和 t 检验比较 KOs，NSTI（Nearest Sequenced Taxon Index，最近测序分类单元指数）在 VM 为0.15–0.31、AN 为0.19–0.47，>0.15提示参考基因组较少，结果需谨慎解释；物种间代谢途径相对频率总体变化不大，好氧呼吸（氧化磷酸化、Krebs 循环、糖酵解）和光合作用（CO₂固定、氧化光磷酸化）相关功能最丰富；水解酶合成相关 KOs 中，木聚糖分解相关 KOs 在 AN 为1.093%、VM 为0.058%，纤维素分解相关 KOs 在 AN 为1.066%、VM 为0.056%；氮代谢相关 KOs 包括硝酸盐同化、反硝化、异化硝酸盐还原（DNR, dissimilatory nitrate reduction）和同化硝酸盐还原（ANR, assimilatory nitrate reduction），DNR 与 ANR 相关 KOs 在 AN 更高；氨代谢相关 KOs 包括 hao、羟胺脱氢酶和 narHG；脲解相关 KOs（脲酶 γ/β 亚基 [EC: 3.5.1.5] 和尿素羧化酶 [EC: 6.3.4.6]）在物种间存在差异；硫代谢相关 KOs 包括异化硫酸盐还原的 dsrAB、aprAB、硫酸腺苷酰转移酶、硫代硫酸盐还原酶 phsAC 和 phsB，同化硫酸盐还原的 CysCDIJHN、PAPSS 和 sir，以及硫和硫酸盐转运 cysAPUW，但未检出硫氧化（Sox）基因；氢营养型产甲烷（Met Hidrog）相关 KOs 丰度高且两物种相似，尤其甲基辅酶 M 还原酶 mcrABCG 和异二硫还原酶，产甲烷相关 KOs 在 AN 更频繁。结论是两宿主功能谱总体相似但在碳、氮循环相关功能上存在差异。

讨论部分总结：本研究探索两凤梨科植物植物积水叶腋原核群落结构及其与理化参数的关联；已有研究显示植物物种可塑造叶、根和根际微生物群落，但该问题在凤梨科植物积水叶腋尤其 campo rupestre 中仍开放。结果部分支持宿主性状和微生境条件塑造群落结构与功能的假设：两物种共享核心微生物群，但形态和理化差异驱动关键微生物类群和代谢途径分异；形态效应需谨慎解释，单物种种内罐径/深度变异不一定与微动物丰富度相关，提示理化与景观尺度因素可能超过纯形态计量因素。VM 具持久叶和多个叠置蓄水叶腋及中央罐，AN 为单一较暴露中央罐，这些差异可影响 pH、光穿透、有机质积累和持水，进而塑造微生物多样性；VM 分布于更暴露区域，可能影响温度和蒸发动态。pH 在 AN 中更受约束，凤梨科罐内 pH 通常4.0–6.5，有机质分解和 CO₂积累可酸化环境，光合活动可提高 pH。罐内有机质降解是养分循环关键：大型无脊椎动物将粗颗粒有机物（CPOM, coarse particulate organic matter，>1000 μm）破碎为细颗粒有机物（FPOM, fine particulate organic matter，<1000 μm），支持微生物活动并将养分矿化为植物可利用形式；两物种可溶性 TN 约1.4 mg·L^?1，与富营养湖泊相当，支持微生物活动。PICRUSt 预测功能包括复杂多糖（果胶、纤维素、几丁质、木聚糖）降解，符合植物材料和节肢动物输入；中心代谢途径（糖酵解、三羧酸循环（TCA cycle）、氧化磷酸化）及以延胡索酸、硫酸盐、硝酸盐、砷酸盐为替代电子受体的厌氧呼吸途径反映罐内氧化还原梯度。PICRUSt 准确性受参考基因组限制，在含大量未表征类群的植物积水叶腋中应谨慎解释。VM 中 IC 显著更高，可能与碳输入、转化或微生物过程差异有关，但这些机制未直接测定；产甲烷古菌 Candidatus Methanoregula 和 YC-E6 在 AN 更丰富，提示氧化还原差异和微生境变异；Crenarchaeota 的 pGrfC26 仅在 AN 检出，其生态作用知之甚少，可能指示被忽视的生态位。氮代谢基因广泛分布，包括固氮、同化和反硝化；反硝化基因可能与 Pseudomonas、Magnetospirillum 和 Azospirillum 等属相关，固氮菌包括自由生活和共生类型，共生固氮菌包括 Rhizobium、Bradyrhizobium、Mesorhizobium 和 Burkholderia，自由生活固氮菌包括 Azospirillum、Beijerinckia、Pseudomonas、Desulfovibrio、Paenibacillus 和 Clostridium，亦检出 Methanobacterium 等古菌；这些类群此前在凤梨科罐和池塘中有报道。罐内有机质分解导致氧耗尽，形成强氧化还原梯度，促进硝酸盐、硫酸盐和 CO₂ 等末端电子受体的分层利用，使好氧、微好氧和厌氧代谢共存；反硝化、硫酸盐还原和产甲烷基因的检出反映这种分层氧化还原结构，并强调微生物联合体在氧限制下维持生物地球化学循环的作用。分类谱与既往凤梨科研究一致，以 Proteobacteria、Acidobacteria、Firmicutes、Verrucomicrobia、Planctomycetes 和 Bacteroidetes 为主；Alphaproteobacteria（尤其 Hyphomicrobiaceae、Rhodospirillaceae、Acetobacteraceae）及 Acidobacteria 和 Verrucomicrobia 在两物种中的存在强化了 Aechmea 和 Neoregelia 中已描述的模式，指示对微好氧和寡营养条件的适应；VM 相关研究较少，因此检出相似微生物类群值得注意。Alphaproteobacteria 和 Gammaproteobacteria 通常在凤梨科相关群落中占优势，而 Pedosphaerae、Planctomycetia 和 Clostridia 等类群常见于多种植物内生和根际环境，其在植物积水叶腋中的出现提示这些水生微生境可能是陆生植物—土壤系统相关类群的储库或招募位点，支持凤梨科罐作为“水生类土壤微宇宙”的观点。优势科 Rhodospirillaceae、Comamonadaceae、Chthoniobacteraceae 和 Pirellulaceae 具有相关生态作用；Chthoniobacteraceae 包含能降解植物多糖的细菌，指示在碎屑分解中的关键作用；Pirellulaceae 在 AN 中更高，尽管其曾被报道与较高 pH 相关，这可能提示微生境尺度 pH 异质性或生态位分化，需进一步研究。Candidatus Xiphinematobacter、Chthoniobacter、Magnetospirillum 和 Sporomusa 等属的检出拓展了对这些系统微生物多样性和功能潜力的理解；Candidatus Xiphinematobacter 与 Xiphinema 属线虫建立长期特异性关联，Xiphinema 也曾在大西洋森林凤梨科罐中报道；Chthoniobacter 包括能代谢植物生物质糖类组分的需氧异养菌，Sporomusa 包括严格厌氧发酵细菌。

结论翻译：总之，尽管所研究的两种凤梨科植物共享约80.3%的微生物属，研究结果揭示其微生物群落结构和预测功能以细微但有生态意义的方式不同。这些差异可能与物种特异性宿主性状及 pH、有机质动态、罐形态和内部水化学等局部环境因素相关。此类选择压力似乎促进广泛共享微生物库内的分化，表明环境过滤在塑造植物积水叶腋微生物 assemblage 中起重要作用。尽管样本间功能冗余程度高，特定代谢途径和类群流行度的变化反映微生物群落组成与生境异质性之间的复杂互作。这些发现强化了凤梨科植物罐作为天然实验室—微宇宙的观点，其中微生物生态与演化在生物和非生物因素镶嵌作用下展开。此外，本研究观察到的独特微生物特征和功能潜力凸显了不仅将这类微型水生生态系统作为生态模型、也作为潜在生物指示物进行研究的重要性。理解微生物群落如何响应环境条件变化，可为监测 campo rupestre 等脆弱生境的生态变化提供有价值见解，尤其面对持续气候变化和土地利用压力。为在这些发现基础上进一步研究，未来研究应结合转录组学和代谢组学等功能方法，并开展纵向和地理更广的采样；这将使研究人员更好捕捉凤梨科植物积水叶腋微生物过程的动态性质，并评估这些微生物群落如何在时间和空间上影响宿主植物生理和养分循环。