壳聚糖基乳状液可食涂膜负载牛至精油主要成分对‘利马’橙酸腐病的防控效果研究

《Brazilian Journal of Microbiology》：Chitosan-based edible coating produced from an emulsion containing the major constituents of oregano essential oil for the control of sour rot in ‘Lima’ orange

　　

摘要 由Geotrichum citri-aurantii引起的酸腐病是影响柑橘类水果最具破坏性的采后病害之一，主要危害‘利马’品种，造成严重的经济损失。除经济影响外，采后病害的管理还与全球减少食物损耗和降低对合成农用化学品依赖的努力密切相关，符合负责任生产相关的可持续发展目标（Sustainable Development Goals, SDGs）。在此背景下，基于活性涂膜的策略已成为传统杀菌剂的有前景的替代方案。本研究开展了体外（in vitro）和体内（in vivo）实验，以评估将壳聚糖溶液与牛至（Origanum vulgare）精油主要成分——香芹酚（carvacrol）、百里酚（thymol）和对伞花烃（p-cymene）——混合制备的乳状液的抗真菌能力。研究人员还对采后橙果施用该乳状液，以评估其理化品质及防御酶活性。所配制的乳状液在微米范围内呈现较宽的油滴粒径分布，并具有良好的成膜能力。体外实验表明，在0.25 μL mL?1浓度下可完全抑制菌落形成，在3.00 μL mL?1浓度下可抑制菌丝生长，而在气相条件下的抗真菌效果较低。当施用于橙果时，7.5 μL mL?1的乳状液降低了病害严重度。处理组在评估的各取样时间点保持了较高的果实硬度值以及更稳定的pH和色泽属性。在特定取样时间点还观察到处理后果实防御酶活性的变化。总体而言，研究结果表明，该乳状液在控制酸腐病的同时保持柑橘类水果采后品质方面是一种有前景的替代方案。

基于壳聚糖-牛至精油主要成分乳状液可食涂膜对‘利马’橙采后酸腐病的防控及果实品质保持研究——论文解读

一、研究背景与意义

柑橘生产是全球最具经济意义的农业活动之一，然而由真菌性病害造成的采后损失严重制约了该产业的盈利能力。在众多致病菌中，Geotrichum citri-aurantii作为酸腐病的病原菌，因其侵染性强、在柑橘果实中传播迅速而尤为突出。与传统的采后主要防控靶标Penicillium digitatum和Penicillium italicum不同，G. citri-aurantii具有更强的组织穿透和增殖能力，且对常规杀菌剂的敏感性较低，使其成为最难管理的病原菌之一。该病害影响多种柑橘种类和栽培品种，其中‘利马’品种因其在鲜果市场的重要性和对酸腐病的易感性而尤为相关，成为评估柑橘采后替代防控策略的适宜模型。

目前，酸腐病的管理主要依赖抑霉唑（imazalil）和噻苯咪唑（thiabendazole）等合成杀菌剂。然而，这些分子的长期使用已导致抗性菌株的选择和不良化学残留的积累，对人类健康和环境构成潜在风险。在此背景下，基于涂膜的采后替代策略受到越来越多的关注。利用精油进行涂膜因其广谱抗菌活性而被广泛研究，但其实际应用常受限于生产成本高、化学成分变异大、提取条件苛刻、气味强烈以及储存条件下不稳定等因素。为克服这些局限，利用具有公认抗真菌活性的精油主要成分已成为一种更标准化且经济可行的策略。香芹酚、百里酚和对伞花烃作为牛至精油的主要成分，主要通过破坏真菌细胞膜发挥抗真菌作用，且已被纳入美国食品药品监督管理局（FDA）的食品添加剂和调味剂监管清单。此外，壳聚糖作为一种来源于甲壳素的半合成生物聚合物，具有良好的成膜能力、生物可降解性和天然乳化稳定作用，已被广泛探索用于可食涂膜应用。

研究人员前期研究表明，这三种化学成分的组合对G. citri-aurantii具有体外协同抑制活性。然而，尽管其抗真菌协同作用已在受控实验室条件下得到证实，这些化合物在果实表面的实际应用仍面临挑战，直接施用可能导致分散不良、快速挥发和在果实表面滞留有限等问题。将活性成分包埋于壳聚糖聚合物基质中，是提高这些生物活性化合物稳定性、分散性和可控释放的有前景的策略。此外，壳聚糖与生物活性化合物还可能刺激果实的宿主防御机制。因此，本研究旨在评估一种稳定的壳聚糖基乳状液（含牛至精油主要成分香芹酚、百里酚和对伞花烃）对G. citri-aurantii的体外抗真菌活性及其对‘利马’橙酸腐病的防控效果，同时研究其对果实理化品质属性和防御相关酶活性诱导的影响。

二、研究内容与主要结论

主要关键技术与方法

研究人员从巴西Embrapa Meio Ambiente的农业与环境重要微生物保藏中心（CMAA）获得从‘利马’橙中分离的G. citri-aurantii菌株。通过将含香芹酚（77.2%）、对伞花烃（18.5%）和百里酚（4.3%）的合成混合物与2%（w/v）酸性壳聚糖溶液混合，利用超声波处理器制备5%（v/v）储备乳状液，并采用动态光散射（DLS）和电泳迁移率测量进行表征。体外抗真菌活性通过三种方法评估：气相间接抑制、乳状液直接覆盖孢子悬浮液、以及含孢子滤纸片置于乳状液涂覆表面。体内实验采用人工接种后喷雾施用的方式进行，评估病害发生率、严重度和潜伏期。采后品质分析包括失重率、果皮色泽、硬度、可溶性固形物（SS）、可滴定酸度（TA）和pH等指标。防御酶活性分析包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）的测定。

体外抗真菌活性评估

在气相间接抑制实验中，菌丝生长抑制率（MGI）随乳状液浓度增加而升高，在最高浓度（50 μL mL?1）下表现出更为显著的抑制响应。非线性指数回归模型（R2 = 0.8867）充分描述了这一浓度-响应关系。在乳状液直接覆盖孢子悬浮液的直接接触实验中，0.25 μL mL?1浓度即可实现孢子萌发的完全抑制。而在孢子悬浮液沉积于乳状液涂覆表面的实验中，需要3.0 μL mL?1浓度才能实现菌丝生长的完全抑制。结果表明，该乳状液在两种直接接触实验条件下均对G. citri-aurantii表现出抗真菌活性，且直接接触方式的抑菌效果显著优于气相暴露方式。

酸腐病防控效果

体内实验结果表明，乳状液的施用促进了接种G. citri-aurantii的橙果酸腐病发生率降低的趋势，其中7.5 μL mL?1浓度处理表现出最大的数值降低，病害抑制率达66.70%。在病害严重度方面，未处理对照果实的病斑直径快速增大，而7.5 μL mL?1处理果实表现出较慢的病害进展，平均病斑直径（MLD）和病害严重度进展曲线下面积（AUDPC）均显著低于对照。7.5 μL mL?1处理还表现出数值上更长的平均潜伏期（5.20天），但该差异未达到统计显著水平。值得注意的是，10.0 μL mL?1浓度处理在果皮表面造成了轻微的表皮损伤，提示该浓度可能不适宜实际应用。

采后品质分析

在采后品质方面，两种处理的果实硬度在后期取样时间点均呈下降趋势，但涂膜果实至储存第8天仍保持高于对照的硬度值。失重率随储存时间逐渐增加，但处理后第2天涂膜果实表现出显著低于对照的失重率。pH值在连续取样时间点略有下降，涂膜样品中观察到较高值。可溶性固形物至第6天保持较高值，但第8天处理组较对照有所降低。可滴定酸度在后期取样时间点略有降低，而SS/TA比值在取样时间点间逐渐升高，第6天处理组达到较高值。色泽方面，所有果实的L和a值均增加，对照组的数值变化更为明显。处理组在整个储存期间表现出较低的b和C值以及较高的h值，表明涂膜有助于维持更稳定的果皮色泽。

防御酶活性分析

乳状液的施用在某些取样时间点显著影响了防御相关酶的活性。苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）活性在处理后最初几小时升高，处理后2小时和第1天显著高于对照，第2天降低后第3天再次升高，随后在后期取样时间点下降。过氧化氢酶（CAT）表现出相似的模式，处理后2小时活性较高，第1天降低，第2天再次升高并显著高于未处理果实。多酚氧化酶（PPO）活性在各取样时间点间存在差异，但与对照的差异一致性较低。过氧化物酶（POD）活性在各取样时间点间的数值变化相对较小，第1天和第4天较对照显著升高，随后处理间活性水平趋于一致。

三、讨论与结论

研究结果表明，该壳聚糖基乳状液对G. citri-aurantii具有有效的抗真菌活性，其作用机制可能与香芹酚和百里酚破坏真菌细胞膜、增加膜通透性并导致胞内成分泄漏有关，而对伞花烃可能通过增加膜流动性和通透性促进酚类化合物的渗透。壳聚糖基质作为载体系统可减少活性成分的挥发和降解，其半透性膜还可减少水分损失和调节气体交换，从而有助于保持果实品质。处理组果实较高的硬度和较低的失重率与壳聚糖涂膜的屏障特性一致，而更稳定的色泽可能与生物活性化合物的抗氧化特性有关。PAL活性的升高提示苯丙烷代谢途径可能被调节，CAT活性的升高则表明果实组织调节活性氧（ROS）的能力增强。

研究存在若干局限性：未包含仅含壳聚糖基质而不含活性成分的配方对照，无法区分壳聚糖基质与活性成分的各自贡献；未进行感官评价，有效浓度下的消费者可接受性尚不明确；10.0 μL mL?1浓度造成的表面损伤提示浓度增加并不一定产生更适宜的处理；乳状液的高多分散性（PDI = 1.0）和实验室规模制备条件也需在大规模生产中优化验证。

总体而言，7.5 μL mL?1浓度的乳状液在病害防控和果实耐受性之间提供了较为有利的平衡，在控制酸腐病的同时保持了柑橘果实的采后品质，是一种有前景的合成杀菌剂替代方案。然而，该浓度尚不应被视为最优商业剂量，未来需通过更广泛的浓度范围评估、感官评价、规模化生产和长期稳定性研究来进一步确认其商业应用潜力。