巴西东南部禽源非克隆 Salmonella Minnesota ST548 的基因型与系统发育特征及其公共卫生风险

《Brazilian Journal of Microbiology》：Genotypic and phylogenetic characterization of Salmonella Minnesota ST548 strains with potential risk to public health

　　

Salmonella Minnesota ST548 已成为家禽产业中的重要血清型，并已在食品中被检出。研究人员利用全基因组测序（WGS）对来自巴西东南部家禽的五株非克隆 S. Minnesota 分离株进行了表征，并分析了 263 条数据库序列的毒力基因、抗菌药物耐药基因（ARGs）和系统发育关系。在分析的序列中，191 株多重耐药（MDR）菌株携带抗菌药物耐药基因（ARGs），赋予对氨基糖苷类（aac(6′)-Iaa、aph(3′)-Ia 和 aadA1）、喹诺酮类（qnrB19）、四环素类（tetA）、磺胺类（sul2）和β-内酰胺类（bla_CMY?2、bla_CTX-M-8、bla_CTX?M?55 和 bla_TEM?126）的耐药性。此外，鉴定出多个与毒力因子相关的基因，包括黏附（faeC、faeE 和 fimB）、菌毛黏附决定因子（pegA、staA、fimA 和 csgD）、镁摄取（mgtB 和 mgtC）、巨噬细胞诱导基因（mig-14）、毒素（cdtB）和分泌系统（ssaM、sseE 和 sseJ）。在分析序列中鉴定出 25 个质粒复制子（plasmid replicons）和 53 个不同的前噬菌体（prophages）。系统发育分析显示，来自巴西东南部的非克隆 S. Minnesota 家禽分离株与来自其他来源和国家、与人暴发相关的 S. Minnesota 序列关系密切。这些发现强调需要在公共卫生和兽医健康两方面对该血清型进行监测。 Impacts：来自巴西家禽的 Salmonella Minnesota（SM）菌株可能携带多种耐药和毒力决定因子，对公共卫生构成潜在风险。来自家禽的 Salmonella Minnesota 菌株携带与医院和动物生产环境中使用的抗菌药物和消毒剂耐药相关的基因。在 SM 序列中鉴定出的可移动遗传元件（mobile genetic elements）和前噬菌体区域可能促进耐药和毒力基因的传播，并支持与 One Health 相关的病原体分子分型。

该研究聚焦非伤寒沙门菌（NTS）的公共卫生与兽医健康风险。NTS 是常见肠道病原体，2017 年估计发生 553,000 例侵袭性 Salmonella spp. 感染并导致 77,500 例死亡；禽肉产品尤其是肉鸡常涉及食源暴发。免疫功能正常者多为自限性腹泻，但儿童、老年人、人类免疫缺陷病毒感染者及癌症治疗者可能发生侵袭性疾病、脓毒症和死亡。在包括巴西在内的主要禽肉生产国，Salmonella Minnesota 已成为商业肉鸡中常见血清型之一，许多分离株分子相似性高；人类感染报告较少，但已有严重临床后果及老年人死亡暴发。NTS 宿主广泛，可携带耐药和毒力决定因子，其传播构成 One Health 挑战；携带抗菌药物耐药基因（ARGs）的病原体可存在于医院和动物生产环境，毒力基因和 ARGs 可通过质粒、转座子及噬菌体介导转导等可移动遗传元件传播。尽管对该血清型关注增加，公共卫生和兽医健康风险仍存在重要缺口。因此，研究人员对巴西东南部家禽中五株非克隆 S. Minnesota 进行表型和基因型表征，比较分析 ARGs、毒力基因、质粒和前噬菌体，并推断所有分析基因组的系统发育关系。研究得出，这些禽源非克隆分离株携带与抗菌药物耐药和毒力相关的基因组特征，且与全球多种来源、包括与人暴发相关的 S. Minnesota 序列遗传关系密切，支持在公共卫生和兽医健康中加强监测。

方法概括：研究人员从巴西圣保罗州 2019—2020 年官方家禽监测中选取 5 株非克隆禽源 S. Minnesota（TECSA Laboratory, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil；SM_04 为 2019 年，SM_01、SM_02、SM_03 和 SM_05 为 2020 年），由 Fiocruz 肠杆菌科实验室确认血清型；用 Illumina NextSeq550 进行全基因组测序（WGS），并从 Enterobase 获取 263 条全球 ST548 序列（覆盖度≥90，近 24 年）。对 268 条序列开展致病岛（SPI）、ARG、质粒复制子、血清型、多位点序列分型（MLST）、毒力因子数据库（VFDB）和前噬菌体搜索工具（PHATEST）等 in silico 分析；对 5 株巴西分离株进行 Kirby-Bauer 药敏和生物膜形成表型评价；以 S. Typhimurium LT2 为外群，经 Prokka、Roary、MAFFT 和 IQ-TREE2（GTR+F+I，UFboot 1000）构建最大似然（Maximum Likelihood）树。

结果部分：基因组组装（Genome assembly）：通过基因组组装质量评估、SeqSero 血清型分析和 MLST 分析得出，5 株巴西分离株基因组 GC 含量为 51%—51.3%，大小为 4,867,437—4,935,001 bp；抗原谱为 21:b:e,n,x，兼容 Minnesota 血清型；所有基因组均属于序列型 ST548。抗菌药物耐药决定因子（Antimicrobial resistance determinants）：通过 ResFinder 等基因型分析和药敏表型分析得出，268 条序列中 191 条为 MDR；全部携带 aac(6′)-Iaa，aph(3′)-Ia 占 36.57%（98/268），aadA1 占 33.58%（90/268）。数据库 263 条中，磺胺类耐药基因占 69.96%（184/263），sul2 在其中的 99.45%（183/184）；四环素类占 69.58%（183/263），tetA 在其中的 97.26%（178/183）；β-内酰胺类占 63.49%（167/263），bla_CMY?2 在其中的 95.80%（160/167）；喹诺酮类占 60.45%（159/263），所有序列携带 qnrB19，99.23%（261/263）存在 ParC [T57S（acc > agc）] 点突变。数据库中少量序列携带氨苄西林、大环内酯、甲氧苄啶、磷霉素和多黏菌素类耐药基因，但 5 株巴西分离株未检出。β-内酰胺类中，6 条序列携带 bla_CTX-M-8，7 条携带 bla_CTX?M?55，3 条携带 bla_TEM?126，这些基因介导包括第四代头孢菌素头孢吡肟在内的大范围β-内酰胺类药物耐药。消毒剂耐药基因 qacE 占 2.28%（6/263），formA 占 1.90%（5/263），sitABCD 占 1.14%（3/263）。5 株巴西分离株携带氨基糖苷类耐药基因、bla_CMY?2、sul2、qnrB1、qnrB19、qnrB81 和 tetA；全部对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢他啶、头孢呋辛和四环素耐药，与基因型结果相关；未检出消毒剂耐药基因。致病岛（SPI）与毒力基因（Pathogenicity islands (SPI) and virulence genes）：通过 SPIFinder、VFanalyzer 和比较基因组分析得出，263 条数据库序列及 5 株巴西分离株中鉴定出 8 个致病岛和 2 个致病染色体区域；5 株巴西分离株的 SPI-4 前 120—130 kbp 区域存在缺陷，SPI-5 前 40—50 kbp 区域存在缺陷；SM_04 的 SPI-3（90—100 kbp）和 SPI-1（60—70 kbp）区域缺失；SM_05 的 C63PI 6—8 kbp 区域存在缺陷。5 个基因组比较中，114 个毒力基因存在于全部 5 株，另 50 个基因由 4 株或 3 株共享；SM_01 与 SM_05 分别携带 ssaM 和 safA、spiC/ssaB 及 pltB 等独有基因，并共享 pegA；SM_03 与 SM_04 共享 slrP。数据库 263 条中，195 个基因属于 13 个毒力因子类别；mig-14 在所有分析序列中检出，调节基因 phoP 占 73.38%（193/263）；cdtB 在 99.23%（261/263）数据库序列及 4 株巴西分离株（SM_01、SM_02、SM_03 和 SM_04）中检出。生物膜相关基因 fimA 占 74.52%，fimH 占 100%，csgA 占 72.62%，csgD 占 73.76%，pefB 占 57.03%，safA 占 6.46%，safB 占 99.62%，safC 占 99.62%，safD 占 46.01%，lpfC 占 100%；5 株巴西分离株均携带 fimH、csgA、csgD、safB 和 lpfC，fimA、pefB、safC 和 safD 仅在 SM_05 中未检出，safA 仅见于 SM_01 和 SM_05。巴西 Salmonella Minnesota 的生物膜形成能力（Biofilm formation capacity of Brazilian Salmonella Minnesota）：通过结晶紫微孔板表型试验得出，5 株均能形成生物膜，SM_01 和 SM_05 为弱黏附，SM_02、SM_03 和 SM_04 为中等黏附。前噬菌体区域与质粒复制子存在情况（Prophage regions and plasmid replicons presence）：通过 PHATEST 和 PlasmidFinder 分析得出，5 株巴西分离株中观察到 6 个不同前噬菌体区域，大小为 22.2 Kb—270.3 Kb，GC 含量为 49.2—52.88；SM_05 不含 Escherichia_phiV10（NC_007804），但为所有评估基因组中唯一携带 Shigella_SfIV（NC_022749）者。263 条数据库序列中鉴定出 53 个不同前噬菌体区域。5 株巴西分离株中存在两种质粒复制子：携带 qnrB19 的 COL(pHAD28) 和 IncC；数据库 263 条序列中共鉴定 25 个质粒复制子，最常见者为 IncC 69.20%（182/263）和 COL(pHAD28) 61.98%（163/263）。Salmonella Minnesota 的系统发育见解（Phylogenetic insights of Salmonella Minnesota）：通过泛基因组分析和最大似然树得出，所有 S. Minnesota ST548 基因组共含 12,405 个基因，包括 3,872 个核心基因、183 个软核心基因、763 个壳基因和 7,587 个云基因；系统树分为 A—H 八个分支，H 分支包含 59.69%（157/263）来自不同来源、国家及 2017—2024 年数据库序列和 5 株巴西分离株，C 分支包含 26.11%（70/268）。核心基因组集合保持开放。SM_01 和 SM_05 与英国食品来源 SAL DD0816、人源 SAL VC8914 及食品来源 SAL VC9641 和 SAL VC8906 聚类；SM_02 与英国食品来源 SAL VC9002、SAL VC8917 及阿联酋禽源 SAL TC7773 聚类；SM_03 与英国食品来源 SAL RC8774 及沙特禽源 SAL WC7020、SAL WC6984、SAL WC6986、SAL WC6988 和 SAL WC6987 聚类；SM_04 与阿联酋禽源 SAL FD8365、SAL FD8357 及英国食品来源 SAL GD8613 聚类。

讨论部分总结：该研究首次对 268 个来自不同来源和时间的 S. Minnesota 基因组进行流行病学分析；5 株巴西禽源分离株与英国和沙特阿拉伯等有人暴发报告国家的序列近缘。英国 1950—1952 年首次报告的人 S. Minnesota 暴发涉及 595 例临床病例和 2 例老年人死亡，提示该血清型在免疫受损人群中可导致严重感染。MDR 菌株可使暴发控制更困难；氨基糖苷类、磺胺类和四环素类耐药基因已在 S. Minnesota 感染中报告。本研究中大量 MDR 序列令人关注，部分携带下一代头孢菌素耐药基因。质粒介导的 bla_CMY?2 和 bla_CTX-M 与既往报告一致，分别编码质粒介导 AmpC β-内酰胺酶和超广谱β-内酰胺酶；ISEcp1 元件和 Inc 质粒与 CMY、CTX-M 酶编码基因传播相关；IncC 质粒复制子在分析序列中最常见，SM_01 中 ISEcp1 位于该复制子内，SM_05 同一复制子携带接合基因 traF 和 traG，编码经 IV 型分泌系统（T4SS）进行质粒转移的蛋白，促进水平基因转移。喹诺酮耐药常与 gyrA、parC 突变及 qnr 型基因表达相关；qnrB19 位于 COL(pHAD28) 质粒，5 株巴西分离株均携带；含该质粒的 EnteroBase 序列中仅 4 株未携带 qnrB19；ParC [T57S] 在 99.23%（261/263）数据库序列及 5 株巴西分离株中检出。qacE、formA 和 sitABCD 分别与季铵化合物、醛类和过氧化物消毒剂耐药相关，代表公共卫生和兽医健康潜在关注；sitABCD 位于 C63PI，编码锰(II)和铁(II)摄取系统组分，可能保护菌体免受氧化应激并解毒活性氧（ROS），支持 Salmonella 在免疫细胞内生存。SPI-4 和 SPI-9 与细菌对上皮细胞黏附调节相关；SPI-4 在 21.67%（57/263）数据库序列及巴西 SM_04、SM_05 中未检出，SPI-9 亦在这两株中未检出；SPI-4 编码 I 型分泌系统（T1SS），分泌非菌毛黏附素 SiiE，介导细菌与宿主细胞紧密接触，促进 SPI-1 III 型分泌系统（T3SS）效应蛋白转运和持续感染，这些区域基因缺失可能减弱分离株毒力。分析序列含多个 T3SS 毒力基因，由 SPI-1 和 SPI-2 编码；SPI-2 T3SS 的 ssaM 和 spiC 为分泌转位蛋白 SseB 和 SseD 所需，后者在宿主膜上形成孔道；但 ssaM 仅见于 27.75%（73/263）、spiC 仅见于 23.57%（62/263）数据库序列，巴西分离株中 ssaM 见于 SM_01、spiC 见于 SM_05。cdtB 在 99.23%（261/263）数据库序列及 4 株巴西分离株中检出，提示 S. Minnesota 可能诱导类似细胞病变；研究提示 cdtB 可能经前噬菌体从 S. Typhi 转移至非伤寒血清型，S. Minnesota 中前噬菌体多样性广泛，但其对毒力的贡献仍不确定。生物膜可增强病原体持久感染和免疫保护，并可促进毒力和 ARGs 水平转移；生物膜相关基因在 5 株巴西分离株和 Enterobase 序列中存在，表型为弱至中等黏附，仍需进一步研究这些基因的表达。结论翻译：本研究表明，在巴西东南部家禽中传播的非克隆 S. Minnesota 分离株携带与抗菌药物耐药和毒力相关的基因组特征，支持对该血清型进行公共卫生和兽医监测的必要性。此外，巴西分离株与来自世界各地的多种来源分离株，包括与人暴发相关的分离株，存在遗传相关性。然而，由于核心基因组和附属基因组分析提示该血清型的泛基因组仍为开放型，仍需进一步研究以确定获得额外基因是否会导致严重人类感染或宿主适应。