《Conservation Genetics Resources》：Discovery and validation of a SNP panel to identify hybridization and introgression among three trout species
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人为引入非本地鳟鱼用于游钓已对本地生态系统及其生物产生广泛影响。拉洪坦切喉鳟（LCT；Oncorhynchus henshawi）原产于北美西部，目前同时经历种群下降和杂交，前者与气候变化有关，后者与非本地鳟鱼引入有关。研究人员对来自120多个种群的3,205
人为引入非本地鳟鱼用于游钓已对本地生态系统及其生物产生广泛影响。拉洪坦切喉鳟（LCT；Oncorhynchus henshawi）原产于北美西部，目前同时经历种群下降和杂交，前者与气候变化有关，后者与非本地鳟鱼引入有关。研究人员对来自120多个种群的3,205份样本进行限制性位点关联DNA测序（RAD-seq），以评估杂交并开发一套单核苷酸多态性（SNP）标记组合，用于鉴定三个分类群之间的杂交：拉洪坦切喉鳟、虹鳟（Rainbow Trout）和黄石切喉鳟（Yellowstone Cutthroat Trout）。这些标记将促进对杂交状态的持续表征，并指导研究环境与人为因素如何影响该系统中的杂交。
非本地物种引入威胁生态系统服务、生物多样性和本地物种存续。非本地鳟鱼被广泛放流用于休闲垂钓，可通过捕食、竞争和杂交对本地鳟鱼造成负面影响。虹鳟（RBT；Oncorhynchus mykiss）是全球引入最广的鲑科鱼类，可与本地鳟鱼产生可育后代，导致生物多样性丧失、生态与遗传同质化以及远交衰退。美国《濒危物种法案》对杂交个体保护的政策尚未解决，当前共识是杂交个体不受保护。杂交对本地切喉鳟尤其有害，因为许多种群仅存在于小而隔离且日益碎片化的群体中。LCT原产于内华达、俄勒冈的大盆地沙漠及加利福尼亚东部内华达山脉，具有湖栖和河栖两种生活史策略，适应沙漠溪流、高盐沙漠终端湖和贫营养高山湖。地质时期，LCT因更新世拉洪坦湖干涸而经历自然碎片化与隔离；近两百年，气候变化、干旱、生活与农业引水导致湖泊干涸、栖息地改变以及非本地鳟鱼引入加速了碎片化。这些影响使LCT从其历史分布区约90%消失，1970年被列为濒危，1975年降为受胁。历史上和持续放流RBT及较少量的黄石切喉鳟（YCT；O. virginialis bouvieri）是LCT管理的重要障碍，未检测到的渐渗妨碍保护。与RBT杂交是LCT保护的主要关切；曾认为杂交仅限于小部分分布区、94.7%的占用溪流已证明或被认为未杂交，但后来在多个原认为未杂交溪流中发现杂交，并在原先无该鱼的栖息地发现非本地鳟鱼。全范围采样可建立比较性杂交基线、促进SNP标记设计并减少 ascertainment bias（确定偏倚）。既往LCT研究使用线粒体DNA和微卫星标记，近期SNP研究虽已开发杂交检测面板，但旧面板不再可公开获取，因此亟需更新杂交基线和全范围SNP面板。SNP具有全基因组密度高、基因分型错误和突变率低、跨研究组和平台可重复性高等优势，并可组织成面板用于快速基因分型。研究人员利用RAD-seq开展全范围杂交评估，并开发可量化LCT、RBT和YCT之间杂交的SNP面板，以指导未来采样并为LCT种群监测提供遗传资源。
主要关键技术方法：研究人员于1996—2022年收集3,205份LCT、RBT和YCT样本，覆盖120多个种群；LCT和RBT组织来自加利福尼亚、内华达和俄勒冈，YCT来自怀俄明三个孵化场；California Department of Fish and Wildlife（CDFW，加州鱼类与野生动物部）、Nevada Department of Wildlife（NDOW，内华达州野生动物部）、Oregon Department of Fish and Wildlife（ODFW，俄勒冈州鱼类与野生动物部）和Trout Unlimited提供1,757份新收集和存档LCT，NDOW提供226份RBT，怀俄明三个孵化场提供42份YCT，并重测Hemstrom et al. (2022)的1,180份LCT。采用SbfI的RAD-seq建库，在Illumina平台进行150 bp双端测序；以虹鳟参考基因组比对，用ANGSD和NGSadmix评估混合，分别发现LCT/RBT和LCT/YCT诊断位点；用Standard BioTools SNP Type基因分型在94份验证样本和40份Independence Lake独立样本中验证；以RAD-seq混合比例评估127条溪流的杂交率与杂交强度。
研究结果：
候选诊断位点的计算鉴定：RAD-seq共产生110亿条reads，过滤后保留3,205份样本，平均每份1.87百万条reads通过过滤。对769份无可检测渐渗（NDI；No Detectable Introgression）LCT和RBT进行SNP基因型判定，得到16,620个SNP位点，经缺失数据和位点间距过滤后识别136个位点，按次等位基因频率（MAF；minor allele frequency）、杂合率和缺失数据优先排序后保留59个候选SNP。LCT与YCT发现集初始包含12,000个位点，过滤后降至91个，排序后选择16个YCT诊断和20个LCT诊断SNP，与前述59个合并为95个候选位点。候选位点在NDI LCT、NDI RBT和NDI YCT中的平均杂合率分别为0%、14%和9%。该结果表明候选位点可用于后续面板构建。
基于RAD-seq数据的验证：对94份验证样本的95个候选位点进行Standard BioTools检测，37个SNP因未扩增或基因型不准确被排除，最终保留58个位点（LCT 14个、RBT 32个、YCT 12个）。58个位点跨越32条染色体中的25条，其中10个位于OmyA13、5个位于OmyA12；RBT位点跨越19条染色体，YCT位点跨越8条，7条染色体无位点。在LCT基因组上，47个位点定位到组装染色体，覆盖32条LCT染色体中的24条，其余11个仅定位到未放置scaffold，其中7个为13号染色体位点。诊断等位基因在验证样本中接近固定（>0.95）。与RAD-seq混合比例相比，NDI个体平均差异为0.006，LCT/RBT杂种为0.039，LCT/YCT杂种为0.082；在95%阈值下，54份NDI和20份LCT/RBT杂种（全基因组RBT ancestry 30%—57%）的物种判定在面板与RAD-seq间完全一致；20份LCT/YCT杂种（YCT ancestry 4%—11%）中，面板判定15份为杂种，RAD-seq判定14份，两法仅9份一致，其余落在任一方法5%容差内。该结果表明面板与RAD-seq高度一致，但对低比例YCT渐渗的个体判定有限。
使用独立样本的体外验证：对CDFW从Independence Lake采集的40份独立样本进行检测，面板得到的混合比例与CDFW未发表机构内SNP面板结果一致，差异为0.02—0.14，平均0.05。该结果表明面板与独立方法具有一致性。
全范围杂交评估结果：按已知纯度参考个体和读深规则分类后，去除1份三物种均匀混合的污染个体；在其余2,867份预期为LCT的个体中，15个地点共发现117份杂种，87个地点中有15个存在杂种，120次采样事件中检出非杂交个体。YCT渐渗种群的平均杂交率为51%、平均杂交强度为8.3%；RBT渐渗地点的平均杂交率为18%、平均杂交强度为15.5%。7个地点仅在多个采集年份中的一年发现杂交证据。作者报告但标记为可能污染的两组为：Willow、Whitehorse和Little Whitehorse Creeks 2020年采集的17份个体被赋予10%—20%非LCT ancestry且多数同时携带YCT和RBT ancestry；Mosquito Creek 2000年8份中4份被赋予27%—67% RBT ancestry，但均为数据集中最老组织、reads少于350,000，且2021年同溪21份均无任何非LCT ancestry。该结果表明总体杂交水平较低，主要限于管理者已知地点，疑似污染需谨慎解释。
讨论部分总结：研究人员认为该SNP面板是LCT及其两个杂交威胁物种遗传工具的重要补充，可快速识别个体和种群中LCT与RBT的混合以及种群中LCT与YCT的混合，适用于需要可重复量化杂交的长期监测。全范围调查发现杂交总体较低，且多限于既往研究已知地点；与Pritchard et al. (2015)在19个地点重叠，其中16个地点结果一致。分歧涉及Mosquito Creek、Crowley Creek和Willow-Whitehorse basin，作者分别归因于低读长/污染、低残余渐渗与估计噪声难以区分、以及可能的野外或实验室污染。讨论强调标准化采样协议、沿种群栖息地系统采样、考虑切喉鳟与RBT的纵向分布及深水池采样、重复监测和机构间一致记录的重要性；低杂交水平归功于移除非本地鳟鱼和优先保护LCT的管理努力。Quinn Basin的YCT渐渗仍是威胁，但YCT渐渗在地理上似乎受限且未增加。面板方面，RAD-seq虽全基因组信息更强，但全范围年度实施成本高、耗时长且需生物信息学专长；该面板可在近期（1—4代）检测疑似近期引入YCT或RBT溪流中的杂交。面板为非对称设计，32个RBT诊断位点分布于19条染色体，12个YCT诊断位点分布于8条染色体，其判定能力取决于渐渗分类群；回交个体携带少量非本地 ancestry 时仅覆盖有限染色体片段，位点需落在这些片段内才能检测。验证结果显示，LCT/RBT个体判定在RBT ancestry≥10%时可靠（5%—10%可能可靠），两个验证集均无低于8% ancestry的RBT杂种；LCT/YCT杂交更适合作为种群水平筛查工具，会漏检约四分之一携带8%—10% YCT ancestry的个体，随 ancestry 降低漏检更多，但杂种常见种群会被标记。若需对推定回交个体作个体决策，仍需全基因组数据。作者还讨论SbfI为8碱基切割酶，6碱基切割酶如PstI可能产生更多LCT/YCT候选位点，但当前位点已满足研究目标；通过全范围采样、比较候选SNP与RAD-seq ancestry以及用Independence Lake独立样本验证，作者处理了确定偏倚；面板位点分布不均，7条RBT和8条LCT染色体无位点，26%位点跨两条RBT染色体，建议未来修订时在缺乏YCT诊断位点的染色体上增补位点；混合比例对测序深度敏感，低于约500,000 reads时估计噪声接近高度回交个体 ancestry 水平，因此对低深度个体采用更宽容差，Crowley Creek和Eight Mile Creek等低深度样本为主的采集地杂交率应谨慎解读。
研究结论翻译：研究人员的物种诊断SNP面板针对全范围LCT种群设计，可对个体和种群中与RBT和YCT的杂交进行快速、可重复的检测和定量。研究人员为USFWS、ODFW和NDOW近期启动的监测项目提供了使用该面板的若干重要考虑：为准确检测杂交的存在和程度，必须系统采样整个水体；建议开展一致的机构间记录保存，包括栖息地数据和GPS坐标；第三，个体鱼的 panel 结果应根据渐渗分类群谨慎解释：对RBT ancestry≥10%的个体LCT/RBT判定可直接采取行动，而对LCT/YCT个体判定，建议先将个体结果汇总到种群水平再下结论，并在需要个体决策时用全基因组数据确认。该杂交评估可用于优先安排保护工作，包括确定哪些种群应采样以更新杂交分析，以及通过机械或化学清除缓解杂交，以促进LCT在其全范围内的恢复。
