丁香酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生物膜破坏作用及其与抗生素的相加效应研究

《Current Microbiology》：Eugenol Activity Against Escherichia coli and Staphylococcus aureus: Biofilm Disruption and Additive Interactions with Antibiotics

　　

摘要：多重耐药菌的出现及其形成生物膜的能力给感染控制带来了重大挑战。本研究评估了丁香酚（Eug）对来自食品和临床来源的大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌和抗生物膜活性。抗菌活性通过纸片扩散法、肉汤微量稀释法（MIC/MBC）和细菌生长动力学进行评估。抗生物膜活性通过结晶紫染色、菌落形成单位（CFU）计数和扫描电子显微镜（SEM）进行测量。棋盘格法评估了Eug与环丙沙星（ciprofloxacin）和苯唑西林（oxacillin）的联合效果。Eug的抑菌圈直径为13–22 mm，MIC/MBC值为1000–2000 μg/mL。亚抑制浓度显著延迟了细菌生长。大肠杆菌的生物膜生物量减少了高达90%，金黄色葡萄球菌减少了80%，SEM证实了结构改变。棋盘格法揭示了与抗生素的相加相互作用。这些发现为Eug的抗菌特性提供了额外证据，并支持进一步研究其与抗生素联合应对生物膜相关挑战的效果。

研究背景与目的

全球范围内，抗生素的过度使用及不合理应用，结合细菌自身的适应性机制，导致多重耐药（MDR）细菌感染的急剧增加。据世界卫生组织（WHO）数据，2019年抗菌药物耐药性直接导致了超过127万人死亡，全球近500万人因此丧生。耐药菌感染不仅局限于医院环境，在食品工业等非临床领域也构成日益严重的威胁。受污染的食物接触表面可作为致病菌的主要储库，促进交叉污染并在生产和供应链中传播耐药菌株。此外，细菌形成生物膜的能力加剧了持续性污染问题。生物膜是由微生物细胞嵌入自身分泌的胞外基质中形成的结构化群落，其主要成分包括多糖、蛋白质、胞外DNA和水，可作为物理和生化屏障，阻碍抗菌药物的渗透并增强细菌的耐受性。在大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）这两种主要的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中，它们常与食品污染及医疗器械相关感染有关，并能在不利环境条件下持续存在，包括形成持留菌、小菌落变异体（SCVs）和活的非可培养状态（VBNC）等表型不同的存活亚群。在此背景下，寻找替代治疗策略变得尤为迫切，其中包括具有抗菌特性的天然化合物。植物化学物，特别是精油中的酚类成分，因其能够干扰细菌生长、群体感应和生物膜结构而备受关注。丁香酚（Eug）作为丁香油的主要酚类成分，具有广谱的药理活性，包括抗菌、抗炎、镇痛、抗癌和抗氧化作用。已有研究表明其能抑制病原菌生长并破坏生物膜，使其成为替代或辅助抗菌疗法的候选物质。然而，关于Eug对成熟生物膜的影响及其与常规抗生素在耐药革兰氏阳性和阴性菌中的联合作用的研究仍较少。因此，本研究旨在评估Eug对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分离株的抗菌和抗生物膜活性，及其与常规抗生素的相互作用。

研究方法

研究人员采用了以下关键技术方法：1）纸片扩散法和肉汤微量稀释法测定抑菌圈直径（IZD）、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；2）通过监测光密度值绘制细菌生长曲线并计算曲线下面积（AUC）评估亚抑制浓度的生长动力学影响；3）采用结晶紫（CV）染色定量生物膜生物量，并通过平板涂布法对活菌进行菌落形成单位（CFU）计数；4）利用扫描电子显微镜（SEM）观察生物膜结构变化；5）通过棋盘格法计算分级抑菌浓度指数（FICi），评估Eug与抗生素的联合效应。实验所用菌株包括三株从新鲜食品中分离的大肠杆菌（P12、P25、P36）和三株从医院患者中分离的金黄色葡萄球菌（2B、5B、7B），以及标准参考菌株大肠杆菌ATCC 11303和金黄色葡萄球菌ATCC 6538。

研究结果

抗菌效果：Eug对大肠杆菌的抑菌圈直径为13–15 mm，对金黄色葡萄球菌为15–22 mm。所有大肠杆菌的MIC和MBC均为2000 μg/mL，金黄色葡萄球菌则为1000 μg/mL，表明Eug具有杀菌作用，MBC/MIC比值为1。生长曲线分析显示，即使在亚抑制浓度（? MIC）下，Eug也能显著延长细菌生长的迟滞期并减少对数期增长，表现为AUC降低；而在MIC浓度下，两种细菌均无生长。

抗生物膜活性：Eug对预形成的大肠杆菌（P12）和金黄色葡萄球菌（5B）生物膜表现出显著活性。通过结晶紫染色定量发现，与未处理组相比，Eug处理后大肠杆菌生物膜生物量减少约90%，金黄色葡萄球菌减少约80%。同时，CFU计数结果显示，Eug处理使两种菌株生物膜内的活菌数显著下降（>3 log₁₀），且这种减少呈剂量依赖性。

扫描电镜观察：SEM图像显示了未经处理和经Eug处理的生物膜之间的明显形态差异。未经处理的大肠杆菌生物膜致密、排列有序，可见完整的杆状细胞和广泛的表面聚集。经MIC浓度的Eug处理后，大肠杆菌生物膜密度降低，残留的拉长或受损细胞稀疏分布，表面大面积暴露。对于金黄色葡萄球菌，对照组呈现厚实、多层且紧密聚集的球状细胞生物膜，而Eug处理后细胞密度显著降低，仅有少数单个细胞粘附，大部分生物膜结构消失。SEM图像定性显示了形态学破坏，但并未表明生物膜被完全根除。

联合效应：针对耐环丙沙星（Cip）的大肠杆菌（P12）和耐苯唑西林（Oxa）的金黄色葡萄球菌（5B）进行的棋盘格试验显示，Eug/Cip和Eug/Oxa组合均表现出相加效应，FICi范围为0.75至1.0。具体而言，在大肠杆菌P12中，Eug/Cip组合使Eug的MIC降低了4倍，Cip的MIC降低了2倍；在金黄色葡萄球菌5B中，Eug/Oxa组合使两者的MIC均降低了2倍。未观察到拮抗组合（FICi ≥ 2）。

讨论与结论

本研究中观察到的抗菌活性与先前报道一致，Eug对革兰氏阴性和阳性菌均有效。其活性归因于酚类化合物通常通过非特异性膜相互作用而非高度选择性的细胞内靶点发挥作用。亚MIC水平下AUC的降低表明Eug即使在抑制浓度以下也能改变细菌生长动态，但需注意亚MIC暴露可能刺激某些细菌的生物膜形成。抗生物膜活性与先前研究相符，Eug可能通过干扰细菌膜和细胞间通讯（群体感应）来发挥抗生物膜作用。研究人员指出，由于使用了基于培养的方法（如MIC和CFU计数），可能会遗漏VBNC细胞，因此观察到的CFU减少应理解为可培养细菌种群的减少，而非完全根除，需要补充不依赖培养的活力检测方法来确认。SEM观察到的形态学改变进一步支持Eug破坏了预形成的生物膜，损害了其结构完整性和粘附能力，但这些图像应作定性解读，因为生物膜是在玻璃盖玻片上形成的，可能与聚苯乙烯上的结构和复杂性不同。Eug与Cip和Oxa的联合仅显示出相加作用，这可能有助于减少抗生素剂量、降低毒性或选择性压力。Eug可能通过增加膜通透性来促进抗生素进入细胞。总体而言，本研究为Eug作为一种具有微生物学意义的天然化合物提供了额外的实验证据，特别是在其对成熟生物膜的活性及与抗生素联合使用的潜力方面。研究结论为：Eug在体外对代表性革兰氏阳性和阴性菌表现出抗菌和抗生物膜活性。该化合物还影响了细菌生长动力学并促进了生物膜破坏，表现为生物量减少、可培养细胞数量降低以及SEM分析结果。此外，Eug与常规抗生素对耐药分离株表现出相加相互作用。