《Current Microbiology》：Differentially Expressed Infection-Associated Genes in a Shewanella algae isolate From a Deceased Northern Bottlenose Whale
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疾病是对海洋生态系统的重要但了解不足的影响因素。然而，许多野生海洋生物的病原体仍未得到充分表征，限制了对这些病原体生态学及其潜在影响的理解。本研究考察了一株分离自死亡北大西洋瓶鼻鲸（Hyperoodon ampullatus）脑组织的藻类希瓦氏菌（Shewan
疾病是对海洋生态系统的重要但了解不足的影响因素。然而，许多野生海洋生物的病原体仍未得到充分表征，限制了对这些病原体生态学及其潜在影响的理解。本研究考察了一株分离自死亡北大西洋瓶鼻鲸（Hyperoodon ampullatus）脑组织的藻类希瓦氏菌（Shewanella algae）的潜在毒力机制。研究人员采用长读长牛津纳米孔RNA测序（Oxford Nanopore RNA Sequencing）进行差异基因表达分析（DGEA），比较该菌株在标准培养基胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）及添加5%脑匀浆（BH）的TSB中的生长情况，以刺激可能与毒力相关的基因表达。在至少具有两个主要比对读段的7,213个基因中，共鉴定出28个显著差异表达基因，其中23个使用组装基因组鉴定，另有5个使用密切相关的参考基因组检测到的非重叠基因。这些基因与既往研究中已被关联至细菌毒力的过程有关，包括蛋白质转位（例如小信号识别颗粒）、鞭毛运动、趋化和铁获取。功能分析表明，与氨基酸代谢和运动相关的通路上调，而碳水化合物和无机离子转运通路则下调。这些结果表明，环境线索（可能包括与铁代谢相关的因素）可能影响细菌毒力，该研究通过牛津纳米孔RNA测序获得了病原体转录组数据。
研究背景与目的：疾病是影响海洋生态系统的重要但认知不足的因素。许多野生海洋生物病原体特征不明，限制了对海洋生态学和病原体潜在影响的理解。藻类希瓦氏菌（Shewanella algae）是一种革兰氏阴性、可运动、杆状、兼性厌氧菌，传统上分布于热带海洋环境，但近年来已在丹麦等温带地区出现临床病例；该菌可感染布氏鲸（Balaenoptera brydei）、白鲸（Delphinapterus leucas）等大型水生哺乳动物，并越来越多地被确认为机会性感染病原体。然而，S. algae感染和定植宿主的具体机制，尤其是宿主来源环境信号对毒力基因转录调控的影响，仍很不清楚。为此，研究人员从2022年1月在丹麦科灵峡湾搁浅死亡的一头北大西洋瓶鼻鲸（Hyperoodon ampullatus）脑组织中分离到一株β-溶血的S. algae，通过向培养基中添加宿主来源脑匀浆模拟宿主环境，结合全基因组测序和差异基因表达分析（DGEA），识别该菌株的适应性反应和毒力相关通路，以期揭示环境信号如何调节该海洋病原体的毒力基因表达，并为理解海洋哺乳动物病原生态学提供依据。
研究人员采用长读长牛津纳米孔（Oxford Nanopore Technologies, ONT）测序组装了高质量基因组，并将菌株分别在标准胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和含5%脑匀浆（BH）的TSB中培养至指数期，提取RNA后进行直接cDNA长读长测序，通过Salmon和DESeq2进行DGEA。结果显示，在至少具有两个主要比对读段的7,213个基因中，共鉴定出28个显著差异表达基因，其中23个以组装基因组为参考检出，5个以近缘参考基因组ASM918336v2为参考检出。上调基因涉及蛋白质转位、鞭毛运动、趋化和铁获取等与毒力相关的通路；下调基因主要涉及碳水化合物代谢和无机离子转运。这表明宿主来源的环境线索可能通过铁代谢等因素调节S. algae的毒力潜能。该研究将ONT直接cDNA长读长测序应用于海洋细菌病原体的差异转录组分析，为海洋哺乳动物病原体的致病机制研究提供了新的方法学支撑和候选基因资源。
关键方法：样本来自一头2022年1月在丹麦科灵峡湾搁浅的北大西洋瓶鼻鲸（ID:3000）的脑组织，从中分离到β-溶血菌株并鉴定为S. algae。主要技术包括：ONT长读长全基因组测序及Flye/Medaka组装、Bakta注释；制备0%、2%、5%、10%、20%浓度的脑匀浆，并选择5% BH进行培养；RNA经poly(A)加尾和rRNA去除后，采用ONT直接cDNA测序；以Salmon定量转录本丰度，DESeq2进行差异基因表达分析；以GTDB-Tk和TYGS进行物种分类鉴定；以PathoFact2预测推定毒力因子。
研究结果：
基因组组装与注释：研究人员通过长读长全基因组测序获得高质量的S. algae基因组，总长4.96 Mb，GC含量52.8%，完整度90.79%，污染度2.16%，包含110个tRNA和28个rRNA。GTDB-Tk和TYGS均将该基因组分类为S. algae，TYGS鉴定最近模式菌株为NBRC 103173，数字DNA-DNA杂交值82.4%，超过物种界定阈值，确认该分离株属于S. algae。该基因组为后续转录组分析提供了参考框架。
在脑匀浆中的生长动力学：研究人员测试了不同浓度脑匀浆对细菌生长的影响，选择5% BH作为转录组分析条件，因为该浓度对特定生长速率和倍增时间影响最小，同时能提供足够宿主来源信号。生长曲线显示，增加BH浓度会缩短倍增时间并提高基线吸光度，表明脑匀浆对细菌生长有轻微影响。
直接cDNA测序：直接cDNA长读长测序共产出约300万条读段（1.79 Gb），过滤后保留127万条全长转录本读段（400 Mb），中位Phred质量值由11.2升至14.2，N50读长541 bp，明显长于常规短读长RNA测序的50–300 bp，有利于转录本的表征。测序深度相对于约5 Mb的基因组足以支持差异表达分析。
差异基因表达分析：主成分分析显示TSB与5% BH培养条件下的转录谱明显分离，PC1和PC2分别解释24%和17%的总方差；5% BH处理组内存在较大变异，但整体转录模式仍显示脑匀浆补充引起的差异。
差异表达基因：以组装基因组为参考，在7,213个转录本中鉴定出23个显著差异表达基因；以NCBI参考基因组ASM918336v2为参考，额外检出5个非重叠差异表达基因，共28个显著差异表达基因。上调基因中，编码细菌小信号识别颗粒（sSRP）RNA的基因GEFCMJ_21940变化幅度最大（log
2 fold-change 2.898），其他上调基因涉及N-乙酰转移酶、二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶、鞭毛相关基因（flhF、鞭毛钩蛋白）以及铁转运蛋白通透酶亚基基因feoB。下调基因主要与碳水化合物代谢、无机离子转运和未知功能蛋白相关。PathoFact2预测其中6个差异表达基因编码推定毒力因子。
毒力相关通路中潜在上调基因：研究人员进一步手动检查了未达到显著阈值的基因，发现SecYEG介导的蛋白质转位系统组分（secYEG、ftsY）、鞭毛组装基因（flgG、flgK、fliC）以及铁摄取相关基因（feoA、feoB和TonB依赖性铁转运系统）均表现出潜在上调趋势，提示这些通路可能在宿主来源环境中被激活。
讨论部分总结：研究人员指出，脑匀浆是一种化学成分复杂且未定义的底物，同时改变营养、铁含量、渗透压等理化性质，因此观察到的转录变化不能直接归因于特定宿主信号；且脑匀浆来自死后组织，其生化组成可能因自溶而与健康组织不同。蛋白质转位系统相关基因上调提示分泌能力增强，但未检测到编码分泌毒素或效应蛋白的差异表达基因，表明这可能是对分泌相关毒力机制的“预激活”而非直接激活。鞭毛相关基因的协调上调可能增强运动、组织侵袭或免疫逃逸，而fliD下调可能减少免疫识别或在富含黏蛋白的环境中优先运动而非黏附。铁获取通路上调与宿主营养免疫限制一致，feoC在基因组中未检出，TonB-ExbB-ExbD复合体未差异表达，提示变化主要发生在转运体转录水平。关于鲸的死因，研究人员强调从脑和肺组织分离到两株16S rRNA基因序列相同的β-溶血S. algae，但该分辨率不足以确认是否为同一菌株；由于样本来自死后尸检，无法区分生前感染与死后定植，也不能证明S. algae直接导致鲸死亡，因此只能视为适应性潜力的证据。
研究结论：本研究表征了一株鲸源S. algae在添加脑匀浆的TSB中培养时的转录反应，观察到蛋白质转位、鞭毛合成、趋化、铁获取和中心代谢相关基因的差异表达。其中多个过程此前已被关联至细菌宿主互作，但其表达改变也可能反映对该复杂底物的一般生理或代谢适应。脑匀浆作为组织来源底物，其化学成分未表征，因此转录变化无法归因于特定宿主因子，营养可利用性、铁含量、生长生理和其他理化性质的影响也无法区分。该分离株来自脑组织，另有一株近全长16S rRNA基因序列无法区分的分离株来自肺组织，但样本均采集自死后，故不能区分生前感染与死后定植，也不能确立S. algae在该鲸死亡中的因果作用。本研究进一步证明了ONT直接cDNA长读长测序用于细菌分离株差异转录组分析的适用性，所鉴定的基因和通路为后续利用更多分离株、确定实验条件和功能试验开展研究提供了候选对象。
