《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：A protocol for vaginal wall-derived organoids from women with pelvic organ prolapse and benign controls: limited applicability to pathological uterosacral ligament tissues
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目的：盆腔器官脱垂（POP）显著损害女性生活质量；然而，缺乏可靠的人源体外模型阻碍了其发病机制阐明和靶向治疗开发。本研究旨在建立可重复方案，从人阴道壁和宫骶韧带（USL）组织生成患者来源类器官，并界定该模型用于POP研究的适用性边界。方法：从POP患者（分期≥
目的：盆腔器官脱垂（POP）显著损害女性生活质量；然而，缺乏可靠的人源体外模型阻碍了其发病机制阐明和靶向治疗开发。本研究旨在建立可重复方案，从人阴道壁和宫骶韧带（USL）组织生成患者来源类器官，并界定该模型用于POP研究的适用性边界。方法：从POP患者（分期≥III，n=3）和良性对照（n=2）获取阴道壁和USL组织。每个生物学样本在两种平行培养方法中测试三个独立技术重复，包括解离原代细胞和消化组织碎片。组织使用II型胶原酶（collagenase II）和DNase联合处理并消化。原代细胞和消化组织碎片在三维（3D）Matrigel系统中培养，使用补充生长因子的专用类器官培养基，生长因子包括Wnt3a、R-Spondin 1和Noggin。成功的类器官形成前瞻性定义为：在明场显微镜下形成边界清晰、离散的三维球形或囊性结构，持续生长至少7天，直径≥100 μm。随时间监测类器官形成、生长和形态。对POP患者来源类器官进行免疫荧光染色以分析其细胞组成。检测KRT14（上皮）、vimentin（成纤维细胞相关）、α-SMA（肌成纤维细胞/平滑肌相关）、VWF（内皮）和SM22（平滑肌）。结果：在明场显微镜下，良性对照阴道壁组织的原代细胞在培养第一周内形成类器官。至第11天，观察到直径约100–500 μm的清晰三维结构。相比之下，POP患者阴道壁来源类器官表现出相似形态，但数量更少且密度更低。当未消化组织碎片培养48 h形成细胞聚集体，然后分散并重新包埋于Matrigel时，类器官产量显著高于仅以离散原代细胞起始的培养，并且类器官生长维持至第二传代。良性对照USL的原代细胞和组织碎片均生成类器官，而POP患者USL组织在相同条件下未形成类器官。阴道壁来源类器官的免疫荧光分析显示上皮标志物KRT14表达，而未检测到vimentin、α-SMA、VWF和SM22。这些发现表明这些类器官主要由上皮细胞组成。结论：研究人员提出一种初步方案，可从POP患者和良性对照生成阴道壁来源类器官，该方案可能作为研究POP上皮生物学的有用体外工具。重要的是，POP患者的病理USL组织在相同条件下未能形成类器官，而良性对照USL可以形成；这一阴性结果界定了当前适用性边界，并表明该方案尚不适合从病理USL生成类器官或模拟USL来源病理。因此，在POP研究能够广泛适用之前，需要在更大队列中进一步优化和验证。
盆腔器官脱垂（POP，pelvic organ prolapse）是常见妇科疾病，表现为阴道前壁或后壁、子宫或阴道顶端下降，常导致盆腔压迫、排尿功能障碍和排便困难，严重损害女性生活质量。流行病学预测至2036年全球发病将达1.56亿，给医疗系统带来显著社会经济负担。尽管POP高发，其病因机制仍未充分阐明；手术仍是主要治疗手段，但复发率高，5年内再手术率可达30%。这一治疗瓶颈很大程度上反映对维持盆底支持的细胞和分子事件理解有限。POP病理生理研究受可靠实验模型缺乏的限制：动物模型不能复现人盆底独特生物力学和解剖特征；常规二维（2D）细胞培养虽可进行基础机制研究，但传代后迅速失去组织特异表型和细胞异质性；组织活检仅提供静态快照，不能纵向研究疾病进展或治疗反应。因此，亟需保留天然盆底组织细胞结构和功能特征的患者来源体外模型。类器官（organoids，由组织驻留成体干细胞自组织形成的三维培养物）可复现来源器官的关键结构和功能特征，已用于肠、脑、子宫内膜等组织研究；在妇科研究中，子宫内膜、胎盘和卵巢组织来源类器官为植入、滋养细胞侵袭和卵巢癌发生提供了新见解，但类器官技术在盆底疾病尤其是POP中应用不足。本研究旨在建立从阴道壁和宫骶韧带（USL，uterosacral ligament）两种关键盆底组织生成类器官的可重复方案，系统评估解离原代细胞和消化组织碎片两种途径，并表征类器官细胞组成，以填补方法学空白并为POP病理生理研究和治疗评估提供标准化平台。
研究人员纳入POP患者和良性对照，获取阴道壁与USL组织，平行比较原代细胞和组织碎片两种起始方式，在三维（3D）Matrigel体系及含Wnt3a、R-Spondin 1、Noggin等生长因子的类器官培养基中培养，以明场显微镜按前瞻性标准监测类器官形成、生长和形态，并对POP来源阴道壁类器官行苏木精-伊红（HE）染色和免疫荧光（IF）检测KRT14、vimentin、α-SMA、VWF和SM22。研究结论为：阴道壁来源类器官可从POP患者和良性对照生成，但POP来源形成能力较低；良性对照USL可形成类器官，而POP来源病理USL在相同条件下未形成类器官；该方案当前不适用于病理USL来源类器官构建或USL来源病理建模。其意义在于提供阴道壁类器官初步方案并明确适用性边界，为POP上皮生物学研究提供体外工具，同时提示需进一步优化和更大队列验证。
关键技术方法：研究采用患者来源组织，纳入2024年4月至10月成都妇女儿童中心医院子宫切除术患者，POP组3例（POP-Q III期及以上）、良性对照组2例（子宫肌瘤），每例样本设3个独立技术重复。取阴道壁与USL组织，经机械剪碎和酶消化后，平行比较解离原代细胞与消化组织碎片两种起始方式，在三维（3D）基质胶体系中进行类器官培养与传代，以明场显微镜前瞻性判定并监测类器官形成、生长和形态；对POP来源阴道壁类器官行HE染色和IF染色分析细胞组成。
阴道壁组织来源类器官的生成：通过原代细胞培养观察，良性对照阴道壁来源类器官在第一周内持续出现，至第11天形成直径约100–500 μm的清晰三维结构；POP患者阴道壁来源类器官形态相似，但相应时间点数量更少、每视野类器官结构密度更低。由于样本量小且未进行定量计数和统计分析，作者将上述观察限定为定性初步结果。通过未消化组织碎片先培养48 h形成细胞聚集体、再解离并重新包埋于Matrigel的策略，明场下可见其产生的类器官数量高于仅以解离原代细胞起始的培养，并在第二传代仍观察到类器官生长；长期自我更新和超过该传代水平的持续扩增尚未建立。结论是阴道壁组织可生成类器官，组织碎片策略可提高产量，POP来源阴道壁类器官形成能力可能降低。
宫骶韧带组织来源类器官的生成：通过相同培养条件和两种平行策略，良性对照USL的原代细胞和组织碎片均成功形成实性三维类器官，提示该组织含有具备类器官形成能力的细胞群；而POP患者病理USL在原代细胞接种和未消化组织碎片培养中均未观察到类器官形成，其中POP-CD仅见细胞聚集体而非类器官，POP-TD未显示类器官。结论是良性对照USL可生成类器官，而POP来源病理USL在相同条件下未能形成类器官；这一阴性结果界定了当前方案的适用性边界。
POP患者阴道壁来源类器官的免疫荧光表征：仅对从POP患者成功培养的阴道壁来源类器官进行HE和IF分析，USL来源类器官仅良性对照培养成功且未行IF检测。HE显示匹配阴道壁组织具有组织良好的复层鳞状上皮和致密间质，而类器官为小的球形或囊性结构，主要由上皮细胞组成，常见中央嗜酸性角化核心及周围上皮细胞层，缺乏天然组织的复杂间质结构。IF显示类器官中KRT14阳性，形成上皮环或上皮簇，而vimentin、α-SMA、VWF和SM22在类器官结构内未检测到；vimentin阳性细胞见于KRT14阳性类器官周围而非内部，可能代表残留间质/附属细胞，其来源及与类器官微环境的关系尚待研究。结论是阴道壁来源类器官主要由上皮细胞组成，但需检测更多上皮标志物以确认该解释。
讨论部分总结：本研究首次系统将类器官培养技术应用于POP研究，建立从阴道壁和USL生成类器官的可重复方案。健康阴道壁和USL可产生类器官，而POP来源组织类器官形成能力明显受损。POP来源阴道壁类器官形成效率较低，可能涉及机械牵张或产科创伤导致细胞更新和组织稳态缺陷，以及上皮干/祖细胞数量减少或自我更新和分化能力受损，但需更多上皮标志物确认；组织碎片培养可能通过保留关键细胞–细胞和细胞–基质相互作用提高健康阴道壁类器官产量；POP中细胞外基质（ECM）紊乱、胶原降解增加和蛋白聚糖改变，可能使微环境不能有效支持干细胞存活和自组织。USL为富含成纤维细胞和平滑肌的结缔组织，本研究所用培养基主要优化上皮干细胞扩增；POP中USL发生结构重塑，包括平滑肌细胞丢失、胶原降解增加和成纤维细胞活性改变，因此POP来源USL无类器官可能反映上皮/祖细胞群耗竭或功能障碍、间质或平滑肌微环境改变，或培养体系与靶细胞群不匹配；后续需用谱系特异性培养基（lineage-specific media）或共培养系统评估间充质祖细胞功能。局限性包括：患者来源样本量很小，类器官形成仅通过显微镜定性评估而非定量效率检测，未进行组间统计比较；培养体系偏向上皮细胞扩增，未实现上皮与间质细胞在单一类器官中的稳定共培养；缺乏类器官与匹配来源组织的分子比较，KRT14表达及所选间质、内皮和平滑肌标志物阴性仅提示上皮富集表型，未确立组织特异性身份。未来应优化含上皮和间质成分的共培养体系，在更大队列中验证初步差异，量化类器官形成效率并进行组间统计比较，同时采用定量PCR（qPCR）、RNA测序（RNA-sequencing）或单细胞图谱（single-cell profiling）比较对照来源与POP来源类器官及其匹配天然组织，判断疾病相关特征是否保留。
研究结论翻译：研究人员提出一种初步方案，可从POP患者和良性对照生成阴道壁来源类器官，该方案可能作为研究POP上皮生物学的有用体外工具。重要的是，POP患者的病理USL组织在相同条件下未能形成类器官，而良性对照USL可以形成；这一阴性结果界定了当前适用性边界，并表明该方案尚不适合从病理USL生成类器官或模拟USL来源病理。因此，在POP研究能够广泛适用之前，需要在更大队列中进一步优化和验证。
