转录组分析揭示STAT1作为自身免疫性溶血性贫血中T细胞功能障碍的关键转录调控因子

《Frontiers in Immunology》：Transcriptomic analysis identifies STAT1 as a potential key transcriptional regulator of T-cell dysfunction in AIHA

**摘要**

**背景：** 自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia, AIHA）以抗体介导的红细胞破坏为特征。T细胞功能障碍与其发病机制相关，但其潜在的转录机制仍知之甚少。

**方法：** 研究人员通过流式细胞术和RNA测序分析了原发性温抗体型AIHA患者和健康对照者的外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞。进行了转录因子富集分析、ChEA3分析、外部AIHA Treg数据集验证、免疫功能评分及临床相关性检验。在离体实验中，于白藜芦醇或氟达拉滨处理后检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）水平。在AIHA小鼠模型中，研究人员评估了白藜芦醇或氟达拉滨治疗后的LDH、脾脏重量、红细胞结合IgG以及外周T细胞中STAT1和pSTAT1的荧光强度。

**结果：** AIHA组外周CD8⁺ T细胞比例较高，且CD4⁺和CD8⁺ T细胞的转录谱发生改变。转录因子分析确定STAT1是CD4⁺和CD8⁺ T细胞中共同的调控候选因子。在小鼠实验中，AIHA组的LDH、脾脏重量、红细胞结合IgG荧光强度以及外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞中STAT1和pSTAT1荧光强度均高于对照组，而白藜芦醇和氟达拉滨组的上述指标均低于未治疗的AIHA小鼠。

**结论：** 本研究确定STAT1是与AIHA中T细胞功能障碍和溶血活性相关的潜在转录调控因子。这些发现支持进一步研究STAT1相关信号通路作为潜在治疗靶点。

**论文解读：STAT1在自身免疫性溶血性贫血T细胞功能障碍中的转录调控作用**

**一、研究背景与问题提出**

自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia, AIHA）是一组以自身抗体介导的红细胞破坏为特征的异质性疾病，可导致危及生命的贫血。尽管目前采用免疫抑制治疗，但许多患者仍面临难治性疾病或治疗相关并发症，亟需更具靶向性的治疗策略。AIHA的发病机制涉及复杂的免疫失调，其中T淋巴细胞在支持自身反应性B细胞应答和直接介导红细胞破坏中发挥关键作用。然而，驱动AIHA中T细胞功能障碍的分子机制，尤其是转录水平的调控机制，目前仍知之甚少。既往研究虽已描述T细胞亚群的表型改变，但缺乏对AIHA T细胞转录组图谱及其调控机制的综合分析。识别关键转录调控因子不仅有助于深入理解疾病发病机制，还可能揭示具有直接临床转化潜力的新型治疗靶点。

**二、研究内容与总体结论**

为填补上述知识空白，研究人员将基础机制探究与临床相关功能验证相结合，旨在推动AIHA认知与治疗策略的变革。通过对AIHA患者外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞进行转录组测序及综合分析，结合小鼠模型的功能验证，本研究将STAT1确定为与AIHA中T细胞功能障碍及溶血活性相关的潜在转录调控因子，并为其作为治疗靶点提供了支持性证据，为开发更有效、更特异的AIHA治疗手段奠定了科学基础。

**三、关键技术与方法**

本研究纳入了2022年3月至2025年4月间16例新诊断原发性温抗体型AIHA患者及16例年龄和性别匹配的健康对照者，样本来源于南昌大学第二附属医院。研究人员采用流式细胞术分选外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞并进行RNA测序，分析转录组改变；通过GSEA数据库转录因子靶基因集富集分析和ChEA3平台双重筛选共同转录因子候选者；利用外部AIHA Treg RNA-seq数据集（GSE195791）进行独立验证；采用定量PCR验证STAT1表达。体外实验采集AIHA新诊断患者、缓解期患者和健康对照者全血，经白藜芦醇或氟达拉滨处理后检测LDH水平。体内实验采用20只雄性C57BL/6J小鼠建立AIHA模型，随机分为对照组、AIHA组、AIHA+白藜芦醇组和AIHA+氟达拉滨组（每组5只），检测LDH、脾脏重量、红细胞结合IgG及外周T细胞中STAT1/pSTAT1荧光强度。

**四、研究结果**

**1. AIHA中外周T细胞改变及其临床相关性**

流式细胞术分析显示，与健康对照相比，AIHA患者外周血CD8⁺ T细胞比例显著升高，而CD4⁺ T细胞比例无显著差异。相关性分析表明，CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例与疾病活动度的临床指标相关，包括乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）和胆红素相关参数。这提示外周T细胞失衡，尤其是CD8⁺ T细胞区室扩张，与AIHA的临床免疫溶血状态相关。

**2. AIHA中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的转录组重塑**

对分选的CD4⁺ T细胞（5例AIHA和4例健康对照）和CD8⁺ T细胞（4例AIHA和4例健康对照）进行RNA测序。KEGG通路富集分析显示，CD4⁺ T细胞中富集了细胞周期、细胞衰老、卵母细胞减数分裂及免疫相关通路；CD8⁺ T细胞中富集了细胞周期、JAK–STAT以及炎症或免疫相关通路。基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示，AIHA组CD4⁺和CD8⁺ T细胞中B细胞受体信号、系统性红斑狼疮和细胞周期通路富集增加，而核糖体通路富集降低。这表明AIHA中两种T细胞亚型均发生了显著的转录组重塑。

**3. STAT1被确定为AIHA T细胞中共有的转录调控因子**

为识别候选转录因子，研究人员采用两种互补的筛选策略：基于GSEA数据库转录因子靶基因集的富集分析和ChEA3平台预测。通过取交集，STAT1和FOXM1在CD4⁺和CD8⁺ T细胞中被两种方法同时识别。在外部AIHA Treg数据集GSE195791的ENCODE ChIP-seq文库分析中，STAT1（而非FOXM1）是排名最高的候选转录因子。定量PCR进一步支持STAT1在AIHA T细胞中表达升高。因此，STAT1被优先作为共享且受外部数据支持的AIHA相关T细胞失调转录调控因子。

**4. STAT1靶基因表达及其与免疫评分和临床指标的相关性**

STAT1靶基因在AIHA患者CD4⁺和CD8⁺ T细胞中均显示改变的表达模式，表明AIHA T细胞中STAT1相关转录程序被激活。相关性分析显示，CD4⁺或CD8⁺ T细胞中STAT1水平与溶血相关临床指标相关，包括血红蛋白（hemoglobin, HB）、网织红细胞参数、LDH、总胆红素（total bilirubin, TBIL）和间接胆红素（indirect bilirubin, IBIL）。这些发现支持STAT1相关的T细胞失调与AIHA临床疾病活动度之间存在关联。

**5. 药理学STAT1抑制降低活动期AIHA样本的LDH水平**

将新诊断AIHA患者、缓解期患者和健康对照者的全血样本分别用氟达拉滨或白藜芦醇（1、10和100 μM）处理24小时并检测LDH。结果显示，在新诊断AIHA患者样本中，两种药物均以浓度依赖方式降低LDH水平；而在缓解期AIHA患者或健康对照者样本中，LDH水平无明显变化。这表明药理学抑制STAT1相关活性可在疾病活动期降低溶血相关的LDH释放，支持STAT1在疾病活跃背景下的治疗相关性。

**6. 药理学STAT1抑制在AIHA小鼠模型中减轻溶血并抑制STAT1激活**

在AIHA小鼠模型中，与对照组相比，未治疗AIHA组的红细胞结合IgG平均荧光强度、血清LDH水平和脾脏重量均升高。流式细胞术分析显示，AIHA小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞中STAT1表达及活化形式pSTAT1水平均较对照组升高，表明AIHA发展过程中STAT1通路激活增强。白藜芦醇和氟达拉滨治疗均可降低血清LDH水平、减轻脾脏重量和红细胞结合IgG，并伴随外周CD4⁺和CD8⁺ T细胞中STAT1表达和pSTAT1水平的降低。这些结果证明STAT1激活伴随自身免疫性溶血，药理学抑制STAT1信号可降低体内溶血活性。

**五、讨论与结论**

**讨论总结：** AIHA的治疗仍面临重大临床挑战，当前策略主要依赖糖皮质激素和利妥昔单抗，相当比例的患者出现应答不足、复发或不耐受，亟需新型治疗靶点。本研究的发现与既往文献中关于CD4⁺ T细胞减少及CD8⁺ T细胞异常克隆增殖与AIHA发生发展相关的报道一致。外部Treg数据集中的STAT1靶基因富集为STAT1相关转录调控在免疫调节性T细胞群体中的参与提供了补充支持。体外全血实验和小鼠模型的功能验证均支持STAT1抑制可降低溶血活性。然而，研究存在一定局限性：样本量较小且仅纳入原发性温抗体型AIHA患者，结果的外推性受限；体外全血模型无法区分细胞类型特异性效应；所用药物并非选择性的T细胞STAT1抑制剂。未来需通过条件性敲除模型或单细胞方法明确T细胞内在STAT1信号的因果作用。

**研究结论翻译：** 总之，本研究整合了临床观察、转录组分析和功能验证，将STAT1确定为与AIHA相关T细胞功能障碍相关的潜在调控因子。这些发现为在AIHA中进一步开展STAT1相关信号的机制和治疗研究奠定了基础，但仍需更多研究来确定其因果作用。